本发明专利技术公开了一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20‑30℃下振荡孵育2小时，孵育结束后，离心，沉淀用BGT洗脱液浸泡15‑30min，浸泡期间每隔45s用20‑25KHz超声波处理5min，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液；本发明专利技术是未氨基化的原硅胶浓缩效率的7‑8倍；同时也显著高于3‑氨丙基三乙氧基硅烷氨基硅胶(60.65～65.91％)和N‑氨乙基‑γ‑氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅胶(72.65～85.76％)的浓缩效率。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种诺如病毒的富集检测方法，特别涉及一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法。(二)
技术介绍
诺如病毒(NoV)属于杯状病毒，是无包膜单股正链RNA病毒，基因组大小为7624个碱基，包括3个开放阅读框(ORF1、ORF2和ORF3)。根据NoV的全部衣壳基因序列，病毒可分为5个基因组(GI～GV)；目前，已知29种基因型。其中，引起人感染的NoV主要是G I基因组中的8种基因型和G II基因组中的17种基因型。通过突变和重组，诺如病毒的基因组进行着快速的变异，表现出基因的多样化，从而导致新突变株的产生以及急性胃肠炎疾病的大暴发。NoV的感染性强，甚至少于102拷贝数/mL的NoV颗粒都能导致感染。并且，NoV对环境具有较强的耐受性，在酸性(pH 2.7)条件下、加热(60℃)条件及自来水中游离氯(3.75～6.25mg/L)浓度条件下，仍具感染性，预防手段十分有限诺如病毒(Norovirus,NoV)是世界范围内引起人类急性胃肠炎的最常见病原微生物之一，流行地区极为广泛，全年均有流行，感染对象主要为成人和学龄儿童，常分布在医院、餐馆、学校、养老院、家庭等。该病毒主要传播途径为主要通过粪-口途径传播，人感染了诺如病毒通常是由于饮用受污染的水、食品及生活接触，其中饮用受污染的水是重要途径之一。对水中NoV的准确检测能为诺如病毒胃肠炎防控提供科学依据。水体中诺如病毒检测的难点在于含量太低、干扰测定的基本成份复杂，给准确测定造成了很大的困难。大部分水体需先通过水样中病毒的浓缩，才能进行检测，但水中不必要的污染物也因此被浓缩吸附，从而干扰试验结果。如通常使用絮凝沉淀法对水样进行浓缩，但其残留的有机物质可能会对PCR结果造成影响。另外传统的病毒浓缩方法，如细胞培养病毒鉴定，在操作上比较耗时，在技术成本的花费上比较昂贵，而且病毒很难在体外环境下进行培养。因此开发病毒的检测新技术，研究病毒的环境行为和风险评估已引起国际研究界广泛关注。由于硅胶具有良好的化学稳定性、热稳定性以及良好的机械强度，在催化、离子交换、金属富集和色谱技术中应用很多。利用硅胶表面含有大量的活性硅羟基，用乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺等胺类化合物进行表面化学键合或改性，可获得吸附性较好的改性硅胶产品。对合成的氨基化硅胶材料及其吸附性能的研究一直是人们关注的热点。目前氨基化硅胶已经广泛应用于生物医药、电化学、污水处理及杀菌剂等。本专利技术主要通过对一类氨基化硅胶病毒吸附特性的研究，开发一种快速、经济和高效的氨基化硅胶吸附富集诺如病毒的方法。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种操作简便、省时高效的水体中诺如病毒的富集方法，它以水体中的诺如病毒为对象，采用氨基化硅胶吸附，又在超声波辅助作用下经特定洗脱液洗脱分离，实现水体中诺如病毒的富集浓缩及检测。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20-30℃下振荡孵育2小时，使氨基化硅胶与病毒颗粒充分接触，孵育结束后，将氨基化硅胶悬浊液(即混合液)离心，取吸附有病毒颗粒的氨基化硅胶沉淀用少量BGT洗脱液浸泡15-30min，浸泡期间每隔30-45s用20-25KHz超声波处理(即超声波振荡辅助洗脱)5min，超声处理结束后，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液，检测浓缩液中诺如病毒含量，根据浓缩倍数，获得待测污染水样中诺如病毒含量；所述氨基化硅胶是由胺类化合物与硅胶混合，采用物理包裹法制备而成，所述胺类化合物为下列之一：聚乙烯亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷；所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏，0.05％吐温80，溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5。进一步，所述含有诺如病毒的待测污染水样中病毒含量为4.39×101～4.39×1010拷贝/mL，含有诺如病毒的待测污染水样体积加入量以氨基化硅胶质量计为10ml/g。进一步，所述胺类化合物为聚乙烯亚胺，分子量(600、1800、10000)，优选分子量为600。进一步，所述BGT洗脱液体积用量以混合液离心获得的沉淀质量计为1.5-3ml/g。进一步，所述硅胶粒径40-75μm，中性pH，比表面积480m2/g。进一步，所述氨基化硅胶按如下方法制备：将活化后的硅胶与0.01-2mg/ml胺类化合物的有机溶剂溶液混合，在20-60℃下振荡培养，离心，取沉淀用溶剂洗涤之后，烘干，获得氨基化硅胶；所述有机溶剂为甲醇或甲苯，所述溶剂为0.5mol/L H2SO4水溶液、去离子水、1mol/L氨水、甲苯、丙酮或甲醇；所述胺类化合物的有机溶剂溶液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g。更进一步，所述氨基化硅胶按如下方法之一制备：(1)将硅胶加入1mol/L硝酸双蒸水溶液，加热至微沸状态，持续搅拌4小时，反应结束后，产物依次用蒸馏水和甲醇洗涤洗至中性，然后在110℃真空干燥，获得活化后的硅胶；取活化后的硅胶加入到0.5-2mg/mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液中混匀后，60℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用0.5mol/L H2SO4水溶液、去离子水抽滤和1mol/L氨水浸泡5min后离心去上清，沉淀于80℃30min烘干，获得聚乙烯亚胺硅胶；所述聚乙烯亚胺的甲醇溶液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g；(2)将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜，获得活化后的硅胶；将活化后的硅胶加入到0.02-0.03mg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯混合液中混匀后，56℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤，之后于105℃，5h烘干，获得3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶；3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯混合液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g；(3)将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜，获得活化后的硅胶；将活化后的硅胶加入到0.01-0.05mg/mL N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯混合液中混匀后，26℃温度下，持续震荡12小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤之后于105℃，5h烘干，获得N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶；N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯混合液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g。本专利技术重点是针对待测水样中诺如病毒含量低，提供一种浓缩污染水样中诺如病毒的方法，至于浓缩液中诺如病毒含量的检测可以采用本领域公知的方法进行，比如荧光定量PCR方法。具体所述浓缩液中诺如病毒含量检测方法为：采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自德国凯捷公司)提取浓缩液中的诺如病毒RNA，具体步骤按照其说明书进行，提取完毕的病毒RNA于-20℃保存备用。反转录-荧光定量PCR检测：采用One Step PrimescriptTM RT-PCR Kit进行RT-PCR扩增。扩增体系(25μL):2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20‑30℃下振荡孵育2小时，孵育结束后，将混合液离心，取沉淀用BGT洗脱液浸泡15‑30min，浸泡期间，每隔30‑45s用20‑25KHz超声波震荡辅助洗脱5min，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液，检测浓缩液中诺如病毒含量，根据浓缩倍数，获得待测污染水样中诺如病毒含量；所述氨基化硅胶是由胺类化合物与硅胶混合，采用物理包裹法制备而成，所述胺类化合物为下列之一：聚乙烯亚胺、3‑氨丙基三乙氧基硅烷和N‑氨乙基‑γ‑氨丙基三甲氧基硅烷；所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏，0.05％吐温80，溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5。
【技术特征摘要】
1.一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20-30℃下振荡孵育2小时，孵育结束后，将混合液离心，取沉淀用BGT洗脱液浸泡15-30min，浸泡期间，每隔30-45s用20-25KHz超声波震荡辅助洗脱5min，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液，检测浓缩液中诺如病毒含量，根据浓缩倍数，获得待测污染水样中诺如病毒含量；所述氨基化硅胶是由胺类化合物与硅胶混合，采用物理包裹法制备而成，所述胺类化合物为下列之一：聚乙烯亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷；所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏，0.05％吐温80，溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5。2.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述含诺如病毒待测污染水样体积加入量以氨基化硅胶质量计为10-40mL/g。3.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述胺类化合物为聚乙烯亚胺。4.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述硅胶粒径40-75μm，中性pH，比表面积480m2/g。5.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述pH值为7～9。6.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述BGT洗脱液体积用量以混合液离心获得的沉淀质量计为1.5～3ml/g。7.如权利要求1所述基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述氨基化硅胶按如下方法制备：将活化后的硅胶与0.01-2mg/ml胺类化合物的有机溶剂溶液混合，在20-60℃下振荡培养，离心，取沉淀用溶剂洗涤之后，烘干，获得氨基化硅胶；所述有机溶剂为甲醇或甲苯，所述溶剂为0.5mol/L ...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖宁波，章荣华，张严峻，陈江，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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