本发明专利技术公开了一种荧光探针及其制备方法和在检测核酸G-四链体结构中的应用。该类探针具有通式(I)的结构，且结构简单、稳定，容易制备。本发明专利技术还公开了该类探针可用于特异性检测核酸G-四链体二级结构，可通过荧光分光光度计，或者直接通过肉眼观察荧光灯照射下快速检测出溶液中的G-四链体二级结构；该类探针可用于检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中核酸G-四链体结构；也可以用于检测、标记或显示活细胞中G-四链体结构的存在与分布。本发明专利技术的荧光材料对于核酸G-四链体结构具有高效专一的识别能力，同时具有很好的细胞膜通透性，较低的光致毒性、生物毒性和光漂白性等优点，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光探针及其制备方法，以及其在水溶液中、凝胶中和细胞中检测核酸G-四链体二级结构的用途。
技术介绍
核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。核酸大分子分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的核酸二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。随着生物技术的发展，对于核酸标记的要求越来越高，以往通过同位素效应来进行DNA分子测序的方法已经无法满足需求，而荧光标记作为一种具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点的标记技术受到广泛重视，并取得迅速发展。已经发现的染色剂有卟啉类、菁类、苯乙烯类等。而其中的噻唑橙(TO)是一种经典的非选择性菁类核酸荧光探针。除了与其他核酸结合后产生荧光外，TO同样可以结合在G-四链体上，产生强烈的荧光。但是，TO不能从其他形式的核酸分子中有效地识别G-四链体二级结构，因而选择性较差限制了TO的应用。为了改良TO的选择性，我们在TO的结构上引入了苯乙烯基团，得到了一类结构新颖的，且对核酸G-四链体结构专一性强的的荧光探针。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荧光探针。本专利技术的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。本专利技术的再一个目的在于提供上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体结构的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术提供了一种荧光探针，其结构式为下式I所示：式中R1选自或R2、R3、R4、R5、R6、R7分别选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1-6的烷基或C3-6的环烷基；X为C或N。本专利技术同时提供了上述探针的制备方法，表示如下：具体步骤为：将4-氯-2-甲基喹啉与碘甲烷反应，得到化合物将2-甲基苯并噻唑与碘甲烷反应，得到然后将和反应，得到
最后将和不同取代基的芳香醛反应，得到最终探针化合物本专利技术还提供了上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体结构的应用。本专利技术提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当与G-四链体结构发生特异性的作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的核酸混合时，如果该核酸是G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存。(2)本专利技术提供的探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，且光稳定性佳。(3)本专利技术提供的探针具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性。(4)本专利技术提供的探针的光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，在非G-四链体存在的溶液及细胞内具有较低的荧光背景。(5)本专利技术提供的探针可以特异性地检测识别G-四链体结构，实现了G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱仪，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察就可以识别出核酸样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。附图说明图1为为探针6a与AT、DA21、LQ1、Oxy28、random、RNA六种核酸在1∶1浓度
下的荧光谱。图2为探针6a滴定四链DNA(Oxy28)的荧光光谱。图3为探针6a滴定四链DNA(Oxy28)的荧光光谱中C与(F-F0)/F0拟合的曲线.图4为探针6a与双链DNA(ds26)和G-四链体(Oxy28)的聚丙酰胺凝胶电泳图图5为染料DAPI染PC3细胞的细胞成像图.图6为探针6a染PC3细胞的细胞成像图.图7为探针6a与染料DAPI复染PC3细胞的细胞成像图.具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本专利技术的技术方案。通过荧光光谱实验证明，本专利技术涉及的化合物6a由于具有较大的电子共轭体系和平面，与G-四链体结构发生特异性的堆积作用后，荧光光谱发生明显变化，荧光强度增加百倍，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察，同时与其他二级结构的核酸作用较弱，没有明显的荧光信号响应，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。以其中化合物6a为例来说明本专利技术的荧光探针在荧光法(包括荧光显微镜和荧光凝胶成像仪)检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体核酸二级结构的应用。实施例一：化合物2的合成往25ml圆底烧瓶里称取4-氯-喹哪啶0.2g(1.1236mmol)，加入碘甲烷，溶剂环丁砜，将混合物加热到40～60℃，反应18个小时后，冷却，加入无水乙醚后震荡，抽滤，固体洗涤数遍，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到0.345g纯品2，产率为95.8％：1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.22(t，J＝8.1Hz，1H)，8.01(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(s，J＝7.4Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.74(s，1H)，2.68(s，3H).实施例二：化合物4的合成往25ml的圆底烧瓶里称取2-甲基-苯并噻唑0.25g(1.68mmol)，加入碘甲烷、溶剂无水乙醇，80℃下反应15个小时后，将反应后的溶液冷却至室温，然后加入无水乙醇和三氯甲烷混合液，振荡后抽滤，并用少量试剂洗涤沉淀，真空干燥后得到白色粉末状固体0.448g，收率为91.7％：1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(d，J＝8.1Hz，1H)，8.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种G‑四链体荧光探针，其特征在于化学结构式如I所示：式中R1选自R2、R3、R4、R5、R6、R7分别选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1‑6的烷基或C3‑6的环烷基；X为C或N。
【技术特征摘要】
1.一种G-四链体荧光探针，其特征在于化学结构式如I所示：式中R1选自R2、R3、R4、R5、R6、R7分别选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1-6的烷基或C3-6的环烷基；X为C或N。2.一种如权利要求1所述G-四链体荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将4-氯-2-甲基喹啉与碘甲烷反应，得到化合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢宇靖，邓强，张焜，方岩雄，胡冬萍，王郑亚，杜志云，黄宝华，陈俊禧，黄飞鸿，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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