一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，将αTCR及βTCR的基因融合为αβTCR，获得重组质粒后将αβTCR构建成穿梭质粒pMP71‑αβTCR，将αβTCR基因转染γδT细胞，采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗。本发明专利技术利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗，该肿瘤疫苗能够对肿瘤细胞特异性识别，融合细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强，并且能够激活机体受体主动免疫来治疗肿瘤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种疫苗制备方法，尤其涉及一种肿瘤融合细胞的疫苗制备方法，是一种利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗。
技术介绍
恶性肿瘤作为一种严重危害人类的身体健康的疾病，发病率呈现逐年上升的趋势。根据卫生部肿瘤防治办公室的数据显示，近20年来，中国每4至5个死亡者中就有1个死于癌症，已成为威胁国民健康的头号杀手。我国每年癌症发病人数约260万人，死亡约180万人。近年来，肿瘤的免疫治疗备受关注，已成为继手术、放疗、化疗后的第4种治疗方法。主要分两种手段：一是过继性将体外扩增的具有抗肿瘤活性的特异性毒性免疫细胞，特别是将T细胞输入到体内的被动性免疫治疗；二是直接在体内刺激抗原递呈细胞(APC)扩增及细胞因子释放，达到抗肿瘤作用的主动性免疫治疗。以往，针对肿瘤的免疫治疗的研究主要集中于CD8+αβT细胞(CTL)、NK细胞和细胞因子方面，CD8+αβT细胞免疫疗法主要是通过刺激αβT细胞来诱导抗肿瘤反应，但是在肿瘤细胞中经常发现MHC分子的丢失，表现为肿瘤细胞对αβT细胞介导的细胞毒性的耐受，而其他方面的免疫治疗也不尽人意，故在较长一段时间内，肿瘤免疫治疗的基础及临床研究处于相对停滞状态(Lai Q,Ma S,Ge J,Huang Z,Huang X,etc.Tcrgammadelta(+)Cd4(-)Cd8(-)T Cells Suppress the Cd8(+)T-Cell Response to Hepatitis B Virus Peptides,and Are Associated with Viral Control in Chronic Hepatitis B.PloS one.2014；9(2):e88475)。传统上主要采用有抗原肽刺激树突状细胞(DC)，肿瘤细胞提取物致敏DC及基因修饰DC，但因大部分肿瘤缺乏特异性抗原肽，或易诱发自身免疫性疾病，或缺乏特异性筛选标记分子限制了这些方法的使用与效果。近年来，肿瘤细胞直接融合DC来致敏DC取得了良好的效果。尽管DC是体内最强的APC，但PBMCs中提取的DC扩增能力很低，多种因子刺激后至多获取107个混合DC(包含未成熟，成熟及衰老型)，导致它们的抗原提呈能力和持续时间良莠不齐，大大降低DC肿瘤疫苗的治疗效果(Wu Y,Wu W,Wong WM,etc.Human Gamma Delta T Cells:A Lymphoid Lineage Cell Capable of Professional Phagocytosis.J Immunol.2009；183(9):5622-5629)。
技术实现思路
本专利技术针对目前抗肿瘤免疫治疗的缺陷，提供一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，是一种利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗的方法。本专利技术通过以下步骤实现：1.取外周血单核细胞(PBMC)，加入唑来膦酸1μM和人重组IL-2 400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369(10-8M)与β2-微球蛋白(10μmol/l)加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合；用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA-A2-T细胞；刺激7-14天后，对细胞进行梯度稀释可得到HER2特异性T细胞。2.提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物来进行下一步逆转录反应，反应条件：室温10min，42℃1h，99℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase；将反转录的cDNA置于-80度冰箱保存，备用。以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα-以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点。提取的RNA产物行PCR反应，PCR反应程序如下：预热95℃，2min；95℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，(35个循环)70℃10min，4℃停止。凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物；或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71(比例5：1)，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞。以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒。3.用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71-αβTCR和骨架质粒(腺病毒转染需要穿梭质粒与骨架质粒)共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl。取2x105-5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中；2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析；转染成功HER2αβTCR-γδT细胞。4.采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗。将上述转染的HER2-αβTCR-γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS-2-LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×106-15×106/ml，利用电融合仪进行融合得到融合细胞。本专利技术的另一个目的是提供所述方法在制备肿瘤融合细胞疫苗中的应用。本专利技术制备对肿瘤细胞特异性识别且激活机体受体主动免疫的细胞疫苗，增加特异性，提高其在体内的作用时间和效果。本专利技术在制备出肿瘤疫苗后测试其效果，分别对肿瘤细胞进行CCK-8增殖活性检测，LDH细胞毒性反应检测，细胞凋亡流式检测。实验分组：①SAOS-2-LUC肿瘤细胞对照组、②γδT+SAOS-2-LUC细胞组、③HER2αβTCR-γδT+SAOS-2-LUC细胞组、④肿瘤融合细胞+SAOS-2-LUC细胞组，每个组别设置3个重复孔，37℃、5％CO2培养。实验结果表明，该肿瘤疫苗能够对肿瘤细胞特异性识别，融合细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强，能够激活机体受体主动免疫来治疗肿瘤。附图说明图1是显微镜检测γδT细胞体外诱导效果。图2是流式细胞术鉴定γδT细胞。图3是LDH法检测γδT细胞对SAOS的杀伤作用。图4是ELISA检测HER2特异性(*与Control比较P<0.05，***与Control比较P<0.001，n＝3)。图5是CCCK-8检测靶细胞增殖活性(*与Control比较P<0.05，***与Control比较P<0.01，n＝3)。图6是LDH法检测靶细胞毒性反应(*与Control比较P<0.05，**与Control比较P<0.01，n＝3)。图7是流式细胞术检测靶细胞凋亡。具体实施方式本专利技术结合实施例作进一步的说明。实施例1 一种肿瘤融合细胞疫苗制备方法1.外周血单核细胞(PBMC)的分离取外周血单核细胞PBMC(或以RPMI 1640培养基1:1稀释外周血标本，加入含有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液体积比2:1)，500×g离心20min。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单核细胞层，以RPMI 1640培养基洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)取外周血单核细胞，加入唑来膦酸1μM和人重组IL‑2400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369与β2‑微球蛋白加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合，用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA‑A2‑T细胞，刺激7‑14天后，对细胞进行稀释得到HER2特异性T细胞；(2)提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物进行下一步逆转录反应，将反转录的cDNA置于‑80度冰箱保存，备用，以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα‑以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点，提取的RNA产物行PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71，比例5：1，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞，以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒；(3)用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71‑αβTCR和骨架质粒共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl，取2x105‑5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中，2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析，转染成功HER2αβTCR‑γδT细胞；(4)采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗，将上述转染的HER2‑αβTCR‑γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS‑2‑LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×106‑15×106/ml，利用电融合仪进行融合得到融合细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)取外周血单核细胞，加入唑来膦酸1μM和人重组IL-2400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369与β2-微球蛋白加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合，用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA-A2-T细胞，刺激7-14天后，对细胞进行稀释得到HER2特异性T细胞；(2)提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物进行下一步逆转录反应，将反转录的cDNA置于-80度冰箱保存，备用，以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα-以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点，提取的RNA产物行PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71，比例5：1，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞，以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒；(3)用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71-αβTCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱健，陶惠民，梁成振，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33