脑膜炎奈瑟菌血清组X的新的合成寡聚体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及合成新的高级寡聚体及其制备方法。特别地，本发明专利技术涉及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组X(下文中为Men‑X)寡聚体(更特别地四聚体)的化学合成。本发明专利技术提供从使用具有特定链长的经纯化糖的合成途径中获得的Men‑X荚膜寡聚体，并且提供所述新的寡聚体，作为用于开发针对由于Men‑X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的候选物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及合成新的寡聚体及其制备方法。特别地，本专利技术涉及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组X(serogroup X)(下文中为Men-X)寡聚体(更特别地四聚体)的化学合成，及其作为用于开发针对由于Men-X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的候选物的用途。
技术介绍
细菌性脑膜炎引起约1,70,000的年死亡数，在工业化国家中有至少5％-10％病死率，且在发展中国家有20％病死率。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)和脑膜炎奈瑟菌引起全世界大多数的细菌性脑膜炎病例。目前已确定了脑膜炎奈瑟菌的总共13个不同血清组(即A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z)，但感染中约90％是由血清组A、B、C、Y和W135。然而，脑膜炎奈瑟菌的血清组X(Men-X)最近逐渐成为对公共健康的实质性威胁。血清组X被报道出现在北美、欧洲、澳大利亚及西非。疫苗接种被认为是控制感染性疾病扩散的最有效方式。有覆盖脑膜炎球菌血清组A、C、Y及W的数种脑膜炎球菌疫苗，然而目前市场中没有可以防护由血清组X引起的脑膜炎的许可疫苗。所以，存在开发能够提供覆盖血清组X的更广泛保护的更全面疫苗的需求。目前开发了缀合物疫苗以提供针对多糖抗原的更强保护，其通过将弱(多糖)抗原与载体蛋白质(优选来自于相同的微生物)共价连接产生，从而通过T-细胞依赖性免疫应答将所述载体的免疫属性赋予所连接的抗原。寡糖或多糖合成的进步以及生物学研究中开发的新技术已经打开了糖类疫苗设计的新途径。近年来已制备多种有希望的基于糖类的疫苗候选物，其包括天然糖类和合成产生的糖类两者。天然糖类证明为疫苗形成中的重要组分，但其具有许多缺点。与天然
糖类相关的主要缺点是本身非常具有挑战性的分离与纯化。另外，任何生物污染物或残留的工艺杂质带来多种质量保证问题。另外，多糖质量不一致性和多糖大小分布问题导致批次不合格。细菌多糖在可用于缀合前需要进行修饰，导致对表位不同程度的损伤。然而，基于合成糖类的疫苗相对于天然糖类具有许多优势，包括其限定良好的化学结构。任何生物污染的机会也更少，并且因此提供更好的安全谱。另外，合成分子在合成期间可按需要进行修饰以提高在缀合期间的产率，并通过与寡糖分子连接的内置接头(in-built linker)使在缀合过程期间对免疫原性表位的损伤最小化。鉴于Men-X疾病不断提高的发病率，已经有数种方法用于制备合成可模拟天然多糖的合成Men-X寡糖。例如，国际专利申请no.PCT/US2011/037364(题目为“Synthetic oligosaccharide for Neisseria meningitidis vaccine”)公开了用于寡糖及其缀合物的化学合成的方法。该专利技术还提供了用于诊断、治疗和预防由脑膜炎奈瑟菌引起的感染的免疫原性和免疫保护性组合物及其抗体。另外，题目为“Synthesis of Neisseria meningitidis X capsular polysaccharide fragments”的发表文献(Laura Morelli和Luigi Lay；2013卷，第2期，ARKIVOC)公开了三种可缀合Men-X荚膜多糖片段(capsular polysaccharide fragment)的合成。目前用于寡糖合成的现存系统涉及用于合成细菌Men-X多糖的繁琐的生产和纯化工序。这些方法或者消耗时间或者会产生不同大小寡聚体的混合物。虽然有关于连续性寡糖制备的概括性陈述，但并没有关于Men-X四聚体和进一步更高级Men-X寡聚体的制备的可实现的公开。以上公开的现有技术教导了Men-X二聚体和三聚体荚膜多糖的化学合成。它们未公开四聚体的形成并且不能产生高产率的二聚体和三聚体。报道于Beilstein J.Org.Chem.2014，10，2367-2376的三聚体缀合物不能提供良好的免疫原性。另外，现有技术在合成起始步骤中使用-40℃用于O-叔己基二甲基氯硅烷(O-thexyldimethylsilyl chloride，OTDS)脱保护，并且α-磷酸化需要8-9天，然而本专利技术在0℃至室温进行并且在远远更短的时间内完成。另外，现有技术公开了氢化反应为24-48小时，然而本专利技术需要更短的用于氢化反应的时间。专利技术目的因此本专利技术的主要目的是新的Men-X荚膜寡聚体(优选Men-X四聚
体)的合成。本专利技术的另一目的是提供用于新的Men-X荚膜寡聚体(优选Men-X四聚体)合成的方法。然而本专利技术的另一目的是提供利用具有特定链长的经纯化糖的合成途径。然而本专利技术的另一目的是提供能够用于具有增强效力的针对脑膜炎奈瑟菌的缀合物疫苗的合成Men-X荚膜寡聚体。然而本专利技术的另一目的是提供达到纯度物理化学质量标准的合成Men-X荚膜寡聚体制备方法。然而本专利技术的另一目的是其成本效率、增强的效力和改善的保质期。专利技术概述因此，本专利技术涉及新的Men-X荚膜寡聚体的合成，以及通过组合用以构建Men-X寡糖主链的两种构建单元(building block)来合成所述Men-X荚膜寡聚体的方法。所述两种构建单元命名为延伸单元(propagation unit)和末端单元(termination unit)。将所述延伸单元添加至末端单元，所述末端单元在任一端终止该链。用于合成延伸单元的原料为糖单糖，包括葡糖胺盐酸盐，其为丰富且廉价的原料。在一个实施方案中，此合成的关键步骤为制备α或β端基异构体(anomer)，优选糖膦酸酯(sugar phosphonate)的α端基异构体。全部合成顺序在多克级(multigram)规模上进行优化，以该方式其只在几个步骤内包括柱纯化。该糖苷化导致与接头部分连接的α-端基异构体和β-端基异构体的形成。该端基异构体混合物利用柱色谱脱保护并分离，导致产生具α或β接头立体化学的末端基团。所述经纯化形式通过1H-NMR分析确认。该二聚体通过利用偶联试剂(如新戊酰氯(pivaloyl chloride))并随后使用碘进行氧化使延伸单元与末端单元相组合进行制备。为了从二聚体制备四聚体，将二聚体的保护基团(例如乙酸酯基团)脱保护，并利用与产生二聚体相似的条件使其与延伸单元偶联。该迭代的乙酸酯脱保护和偶联将提供四聚体单元。最终步骤包括(如
果需要的话)叠氮基团向NHAc的一步转化，随后通过碱处理进行保护基(例如乙酸酯、苄基和Cbz)的移除，以及氢化将提供期望的Men-X高级寡聚体，包括四聚体、五聚体、六聚体等(包含接头)。本专利技术导致在非常短的时间段内合成所述新的高级寡聚体。本专利技术使将6C接头与寡聚体连接成为可能，其导致通过在缀合期间提供灵活性使空间位阻最小化。此外，本专利技术中的6C接头与糖环直接连接，而不是在现有技术情况中通过磷酸酯连接。如此安置接头使其得以适当地优化，导致免疫原性以及缀合物疫苗产率提高，并会为该化合物赋予更好的稳定性。所有使用新方法设计成用于Men-X荚膜多糖的合成的举例说明性步骤导致寡聚体更好的产率、增强的抗原性(如图1所示)以及超过9本文档来自技高网...

【技术保护点】
合成寡聚体的新方法，所述方法包括以下步骤：‑合成半缩醛化合物(10)，‑合成延伸单元(12)以及末端单元(14)和(14A)，‑在偶联试剂的存在下，将所述延伸单元(12)与所述末端单元(14)偶联，并将所述延伸单元(12)与所述末端单元(14A)偶联，以分别产生化合物(15)和(15A)，‑将所述化合物(15)和(15A)与脱乙酰化试剂反应以获得化合物(16)和(16A)，并且随后利用所述偶联试剂将化合物(16)和(16A)偶联以获得化合物(17)和(17A)，‑在所述脱乙酰化试剂和所述偶联试剂的存在下迭代反应以产生新的高级合成寡聚体(18、18A、19、19A、1、1A、X、XA)，‑通过还原性N‑乙酰化试剂一步还原，利用所述脱乙酰化试剂进行脱乙酰化并通过氢化进行苄基和Cbz的最终脱保护，使得所述方法产生具有更好产率、高纯度和增强效力的新的高级合成寡聚体(X)和(XA)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.25 IN 526/DEL/20141.合成寡聚体的新方法，所述方法包括以下步骤：-合成半缩醛化合物(10)，-合成延伸单元(12)以及末端单元(14)和(14A)，-在偶联试剂的存在下，将所述延伸单元(12)与所述末端单元(14)偶联，并将所述延伸单元(12)与所述末端单元(14A)偶联，以分别产生化合物(15)和(15A)，-将所述化合物(15)和(15A)与脱乙酰化试剂反应以获得化合物(16)和(16A)，并且随后利用所述偶联试剂将化合物(16)和(16A)偶联以获得化合物(17)和(17A)，-在所述脱乙酰化试剂和所述偶联试剂的存在下迭代反应以产生新的高级合成寡聚体(18、18A、19、19A、1、1A、X、XA)，-通过还原性N-乙酰化试剂一步还原，利用所述脱乙酰化试剂进行脱乙酰化并通过氢化进行苄基和Cbz的最终脱保护，使得所述方法产生具有更好产率、高纯度和增强效力的新的高级合成寡聚体(X)和(XA)。2.如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述新的高级合成寡聚体(X)和(XA)为四聚体(1)和(1A)。3.如权利要求1和权利要求2所述的合成寡聚体的新方法，其中合成所述四聚体(1)和(1A)所用时间为225小时至276小时，优选257小时。4.如权利要求1和权利要求2所述的合成寡聚体的新方法，其中通过氢化对化合物(1)进行所述最终脱保护所需的时间为10小时至15小时，且对于化合物(1A)为6小时至8小时。5.如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述半缩醛化合物(10)通过以下合成：a.使化合物(2)的糖经受重氮基转移试剂和随后乙酰化以获得化合物(3)，b.使化合物(3)与供体基团反应以获得化合物(4)，c.使所述化合物(4)在有机溶剂中与脱乙酰化试剂反应以获得化合物(5)，d.使所述化合物(5)经受亚苄基保护，产生化合物(6)，e.使所述化合物(6)经受苄基保护以获得化合物(7)，f.使如此获得的所述化合物(7)经受区域选择性亚苄基开环试剂以获得化合物(8)，使其经受酰化试剂以获得化合物(9)，g.使所述化合物(9)在0℃至室温下经受硫代甲苯基脱保护以获得半缩醛化合物(10)。6.如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述延伸单元(12)通过以下合成：使所述半缩醛化合物(10)经受亚磷酰化试剂以获得化合物11，使其经受端基异构化以获得化合物12。7.如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述末端单元(14、14A)通过以下合成：-使化合物9经受糖苷化反应，产生接头连接以获得化合物13，-使所述化合物13与脱乙酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：达温德·吉尔，基肖尔·哈拉莱，马诺伊·库马尔·奇卡拉，
申请(专利权)人：默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN