一种制备西瓜霜的纯种发酵方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种制备西瓜霜的纯种发酵法及其制备工艺和用作治疗感染性、炎性相关疾病的药物、保健品及化妆品中的应用。所述方法将西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)按一定比例混合作为培养基，以单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)为发酵菌种，在一定温度条件下经过发酵而制成西瓜霜。此发明专利技术制备西瓜霜的方法与传统生产方式明显不同，具有诸多优点。制备的西瓜霜及提取物具有明显抗菌、抗炎活性，可制成适宜的各种制剂和产品，用于治疗口腔、黏膜及皮肤感染性疾病，如口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎的医药、保健品及化妆品的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域和中药材生产领域，特别涉及一种采用单一菌株—产红青霉菌(Penicillium rubens)纯种发酵制备中药西瓜霜的方法。
技术介绍
中药西瓜霜为葫芦科植物西瓜的Citrullus lanatus(Thunb.)Matsumu.et Nakai成熟新鲜果实与芒硝经加工而成的白色结晶粉末，传统制备方法为：取新鲜西瓜，沿蒂头切一厚片作顶盖，挖去部分瓜瓤及种子，将芒硝填入瓜内，盖上顶盖，用竹签插牢，放入瓦盆内，盖好，置阴凉通风处，待析出白霜时，随时刷下，直至无白霜析出为度。西瓜霜具有清热解毒，消肿止痛的功效，用于咽喉肿痛，喉痹，口疮，其药用历史悠久，被历代医家视为咽喉和口腔的良药，有“喉科圣药”之称。中医传统理论认为，西瓜霜清热泻火，消肿止痛的功效是因为西瓜能清热解暑，芒硝能清热泻火，两药合制，性味增强，起到协同作用而发挥药效。目前，对于西瓜霜的研究主要集中在西瓜霜复方药物的临床疗效观察及新用途方面，临床上多用西瓜霜复方进行治疗，如桂林西瓜霜(喷剂)、西瓜霜润喉片、西瓜霜清咽含片和桂林西瓜霜胶囊等中成药。由于西瓜霜传统制备方法存在各地加工随意性较大，工艺不统一，污染严重，生产时间长、效率低，工艺繁杂，生产中常见人体致病菌的污染，而且机制不清，质量不稳定、不适应现代化生产的需要，使得大多数西瓜霜生产厂家在20世纪70年代相继停产。本专利技术前期研究发现传统西瓜霜的制备过程实质为微生物参与的发酵过程，其药效物质基础为微生物的次生代谢产物，该研究结果区别于传统认为的芒硝的细小结晶和少量的西瓜氨基酸等为药效物质的认识，基于此，本专利技术将采用发酵法制备西瓜霜，通过明确参与西瓜霜发酵的天然菌种，确定了最佳发酵工艺，从而使其生产周期缩短，药品污染减少，质量稳定。本专利技术还通过抗菌实验证明所制备的西瓜霜对引起咽喉肿痛、口舌热疮等疾病的常见致病菌产生较强的抑制和杀灭作用，从而发挥疗效。本专利技术所制备西瓜霜提取物可以用于制备治疗感染性、炎性相关疾病的药物、保健品、化妆品，感染性、炎性相关疾病包括口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于西瓜霜纯种发酵的菌株产红青霉菌(Penicillium rubens)，所述产红青霉菌来源于以下方法：采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵西瓜霜分离得到1株真菌，并委托中国科学院微生物研究所进行鉴定，出具鉴定报告
【(2016)微鉴字第032号】，鉴定该真菌为产红青霉菌(Penicillium rubens)。其菌落形态及显微鉴定结果见说明书附图1，分子生物学鉴定结果见说明书附图2。另一方面，本专利技术提供了一种采用所述产红青霉菌制备西瓜霜的纯种发酵方法，具体步骤如下：取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝的质量比100:50-100:1加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后接入单一菌种产红青霉菌，在19-27℃条件下，发酵10～20天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，即得西瓜霜。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述方法中西瓜和芒硝的质量比为20:3。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，所述方法中发酵温度是25℃。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，所述方法中发酵天数是15-17天。另一方面，本专利技术提供了所述纯种发酵方法制备的西瓜霜在制备治疗感染性相关疾病的药物中的应用，其中将所述纯种发酵方法制备的西瓜霜用8-12倍量的95％乙醇在20-25℃条件下冷浸提取2-4次，充分搅拌，将不溶性的Na2SO4滤过，合并滤液，40-50℃下减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物，将所述西瓜霜提取物加入药学、保健品、化妆品上可接受的赋形剂或辅料，以常规的方法制备成任何一种适宜的产
品。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述感染性、炎性相关疾病选自口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，所述药物、保健品、化妆品的产品形式选自口腔凝胶剂、膜剂、膏剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂和滴耳剂。本专利技术对制备方法中不同发酵原料比例、不同发酵温度及不同发酵时间进行优化，确定最佳工艺参数，制备得到西瓜霜，并对所述西瓜霜进行提取。采用体外抗菌实验对西瓜霜提取物进行活性研究发现，所述西瓜霜提取物对常见人体致病菌，如金黄色葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾杆菌和大肠杆菌等，具有显著地体外抑制和杀灭活性，因此该提取物为西瓜霜抗菌有效部位。附图说明附图1.西瓜霜发酵菌种的菌落形态及显微鉴定结果。附图2.西瓜霜发酵菌种的分子生物学鉴定—rRNA基因序列测定结果。具体实施方式通过以下实施方式进一步详细说明本专利技术的技术方案。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并
非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1西瓜霜发酵菌种—产红青霉菌的分离纯化1.取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，加入15％西瓜质量的芒硝，混合均匀，常温发酵15天，取发酵液10mL，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL锥形瓶中，用手或在摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20s～30s即成10：1稀释液。然后连续稀释制成10-2～10-9浓度的稀释菌液备用。取0.2mL各浓度的稀释液，采用常规平板涂抹法，将个梯度的稀释液涂布在4种分离培养基中，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于25℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于37℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。2.用接菌环直接蘸取西瓜霜发酵液表面及内部接种于四种不同的培养基中，每日进行一次，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于25℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于25℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。3.每日观察各平板培养基，待长出菌丝或有单菌落形成后，及时挑取前端菌丝或单菌落，转接至相应新鲜的培养基中培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别接于新的平板上进行分离培养，并逐步纯化。对于真菌采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。将纯化后的菌种编号，转入PDA或牛肉膏蛋白胨斜面，
置于4℃保存。4.实验结果：从西瓜霜发酵液中分离得到1株发酵真菌，根据形态鉴定方法进行了初步鉴定，为青霉菌属。5.西瓜霜发酵菌的菌落形态、显微鉴定及分子生物学鉴定对所述发酵真菌的菌落形态进行观察并进行显微鉴定：送检菌种在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较慢，25℃黑暗条件下培养5天，菌落直径15～17mm，质地绒状；产孢结构大量形成，孢子面青灰色；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子梗特化不明显，宽3.0～5.0μm，壁光滑；帚状枝2～4轮生，松散，瓶梗7.4～13.9×2.6～3.4μm；分生孢子近球形、宽椭圆形，浅绿色，表面光滑，3.0～5.0×2.5～4.0μm。未见有性孢子。参见附图1。委托中国科学院微生物研究所进行鉴定，出具鉴定报告【(201本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备西瓜霜的纯种发酵方法，其特征在于，将西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)按一定比例混合作为培养基，以单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)为发酵菌种，在一定温度条件下经过发酵而制成。

【技术特征摘要】
1.一种制备西瓜霜的纯种发酵方法，其特征在于，将西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)按一定比例混合作为培养基，以单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)为发酵菌种，在一定温度条件下经过发酵而制成。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)的质量比100:50-100:1加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后接入单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)，在发酵温度为19-27℃的条件下，发酵10～20天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，即得西瓜霜。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，西瓜和芒硝的质量比为20:3。4.如权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋红，匡海学，舒尊鹏，王长福，
申请(专利权)人：王秋红，
类型：发明
国别省市：广东;44