一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，所述的牡蒿均一多糖是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过1,2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸，且重均分子量为1～20kDa。实验结果表明：本发明专利技术提供的牡蒿均一多糖能明显降低胶原诱导关节炎小鼠的脚肿胀程度和小鼠血清中的炎症因子IL‑6和IL‑17A水平，可望作为主要或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂，对研究开发具有临床应用价值的牡蒿物制剂具有重要意义；另外，本发明专利技术制备方法简单，可以得到高纯度的牡蒿均一多糖，适于规模化生产，实用性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，属于天然药物

技术介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫疾病，不及时治疗的话晚期致残率高达70％，据报道我国目前的类风湿关节炎患者人数已超过500万。临床常用于治疗RA的药物主要为西药，例如：甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶以及炎症因子单抗等，虽然见效快，但是副作用也较为明显。目前，从传统中药中寻找RA的治疗药物已经成为研究热点。牡蒿为菊科蒿属植物牡蒿的干燥全草，其味苦、微甘，性凉，始载于《名医别录》，列为下品，谓：“牡蒿生田野，五月、八月采”，其主要功效为清热、凉血、解毒。现代药理研究表明：牡蒿提取物具有活血、止血、抗炎、抗病毒以及抗氧化作用。中医临床常用牡蒿治疗疟疾寒热、疥疮湿疹等。作为常见的传统中药，目前已经有许多关于牡蒿用于某些炎性疾病治疗的研究报道，例如：专利CN201410229165.6中公开了一种治疗强直性脊柱炎的中药药剂及其制备方法，专利CN201410130133.0中公开了一种治疗慢性前列腺炎的药物，专利CN201310060244.4中公开了一种治疗急性痛风性关节炎的中药组合物，但是至今未见关于牡蒿用于类风湿性关节炎治疗的研究报道。并且上述报道中都是将牡蒿与其它多味中药配伍形成组合物来实施对炎性疾病的治疗，存在配伍成分复杂、毒副作用不清晰等缺陷，使用的牡蒿也都是牡蒿全草，并不清楚牡蒿中具体发挥药效的物质基础。研究表明：牡蒿中含有丰富的多糖、黄酮、多酚、皂苷、挥发油、萜类等物质成分。目前关于牡蒿中的多糖成分的研究报道较少，主要集中在多糖的提取分离方法上，提取的多糖属于混合型多糖，很少有关于牡蒿多糖活性作用的研究报道。尤其是，至今还没有关于从牡蒿中提取均一多糖的研究报道，更没有牡蒿均一多糖用于类风湿性关节炎治疗的研究报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，以拓宽牡蒿的应用范围。本专利技术所述的牡蒿均一多糖，是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过1,2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸。所述牡蒿均一多糖的重均分子量经HPGPC测算为1～20kDa，优选为2～5kDa，以3.1kD最佳。本专利技术所述的牡蒿均一多糖的制备方法，包括如下具体步骤：a)取干燥牡蒿全草，对其进行水提醇沉后冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品；b)对步骤a)获得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，得到牡蒿水洗脱部位多糖；c)将步骤b)获得的牡蒿水洗脱部位多糖上样于葡聚糖凝胶色谱柱，使用NaCl溶液进行洗脱；根据出峰位置收集有效部位，用截留分子量为1000Da的透析袋透析后冷冻干燥，即得所述牡蒿均一多糖。作为优选方案，步骤a)中，先对干燥牡蒿全草用乙醇进行脱脂处理，残渣干燥后再进行水提醇沉。作为进一步优选方案，所述步骤a)包括如下具体操作：先对干燥牡蒿全草用乙醇回流脱脂，脱脂后的残渣经干燥后加入水进行加热提取2～5次，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，加入乙醇进行醇沉，对收集的沉淀进行真空冷冻干燥，即得牡蒿多糖粗品。作为更进一步优选方案，脱脂所用乙醇的质量分数为50％～95％，脱脂时的料液比(g/mL)为1:5～1:20，回流脱脂1～20小时。作为更进一步优选方案，脱脂后的干燥残渣与每次加入的水的料液比(g/mL)为1:8～1:30，加热提取的温度为60～100℃，每次提取的时间为1～5小时。作为更进一步优选方案，醇沉时，向上清液中加入2～4倍体积的质量分数为90～100％的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的质量分数为75～85％，静置12～36小时，收集沉淀物。作为优选方案，所述步骤b)包括如下具体操作：将制得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，硫酸-苯酚法追踪洗脱曲线，收集含糖溶液，减压浓缩，浓缩物透析后冷冻干燥，得到牡蒿水洗脱部位多糖。作为进一步优选方案，所述的碱性阴离子交换柱为DEAE-cellulose柱。作为优选方案，所述步骤c)包括如下具体操作：将制得的牡蒿水洗脱部位多糖用0.1～0.3mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液上样
于葡聚糖凝胶色谱柱，用0.1～0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，利用示差折光检测器进行检测，根据出峰位置收集有效部位；浓缩，用截留分子量为1000Da的透析袋透析，冷冻干燥，即得所述的牡蒿均一多糖。本专利技术所述的牡蒿均一多糖的应用，是指以所述的牡蒿均一多糖作为活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂。本专利技术所述的保健食品或药物制剂的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。与现有技术相比，本专利技术具有如下显著性有益效果：本专利技术首次从牡蒿全草中分离纯化得到一种菊糖型均一多糖，由实验结果表明：本专利技术提供的牡蒿均一多糖能明显降低胶原诱导关节炎小鼠的脚肿胀程度和小鼠血清中的炎症因子IL-6和IL-17A水平，可望作为主要或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂，相对于现有技术，取得了显著性进步和出乎意料的效果；另外，本专利技术制备方法简单，可以得到高纯度的牡蒿均一多糖，适于规模化生产。附图说明图1是实施例1获取的牡蒿水部位多糖的葡聚糖凝胶色谱图；图2是实施例1获取的牡蒿均一多糖的高效液相凝胶色谱图；图3是实施例1获取的牡蒿均一多糖的红外图谱；图4是实施例1获取的牡蒿均一多糖的碳谱图谱；图5是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎的临床评分图；图6是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎的脚肿胀厚度图；图7是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-17A浓度图；图8是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-6浓度图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本发
明而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：牡蒿均一多糖的制备和鉴定1.1牡蒿均一多糖的制备a)取剪碎的干燥牡蒿全草2kg，加入20L质量分数为75％的乙醇回流脱脂(以除去低极性的成分)，回流脱脂10小时后，过滤，得不溶于乙醇的残渣，干燥残渣，然后加入沸水，回流提取两次，每次4h，第一次提取的料液比为1：12(即：1Kg残渣，使用12L水)，第二次提取的料液比为1：10(即：1Kg残渣，使用10L水)；过滤，合并两次提取液，浓缩，加入质量分数为95％的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的质量分数为75％，静置醇沉24小时，过滤，收集沉淀并挥去残留乙醇；对沉淀进行离心，离心后加适量蒸馏水复溶，于-80℃冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品76.7g，得率约为全草质量的3.84％；b)取制得的牡蒿多糖粗品10g，加150mL蒸馏水溶解，离心(10000rpm，10min)，吸取上清液上样于DEAE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡蒿均一多糖，其特征在于：是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过1,2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸，且重均分子量为1～20kDa。

【技术特征摘要】
1.一种牡蒿均一多糖，其特征在于：是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过1,2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸，且重均分子量为1～20kDa。2.一种制备权利要求1所述的牡蒿均一多糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：a)取干燥牡蒿全草，对其进行水提醇沉后冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品；b)对步骤a)获得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，得到牡蒿水洗脱部位多糖；c)将步骤b)获得的牡蒿水洗脱部位多糖上样于葡聚糖凝胶色谱柱，使用NaCl溶液进行洗脱；根据出峰位置收集有效部位，用截留分子量为1000Da的透析袋透析后冷冻干燥，即得所述牡蒿均一多糖。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a)中，先对干燥牡蒿全草用乙醇进行脱脂处理，残渣干燥后再进行水提醇沉。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)包括如下具体操作：先对干燥牡蒿全草用乙醇回流脱脂，脱脂后的残渣经干燥后加入水进行加热提取2～5次，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，加入乙醇进行醇沉，对收集的沉淀进行真空冷冻干燥，即得牡蒿多糖粗品。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：脱脂所用乙醇的质量分数为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王顺春，李宁，施松善，施晨晨，苏娟，刘睿敏，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：上海;31