SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用制造技术

本发明专利技术提供了SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用，还提供了SFRP2作为制备促进牙源性间充质干细胞介导组织再生药物的应用，通过对WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的机制进行的研究，发现其有促进干细胞牙向‑骨向分化的左右，并对其可能的机制进行阐述，从而为研究牙齿和骨骼生长发育时空特异性的分子调控机制及生物性全牙再生的种子细胞的改建提供重要线索。

【技术实现步骤摘要】
本申请要求于2015年05月14日提交中国专利局、申请号为201510246730.4、专利技术名称为“SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本专利技术涉及干细胞
，具体涉及WNT信号调节因子SFRP2促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙定向分化中的应用。
技术介绍
牙齿缺失修复和牙周组织再生一直是口腔科学的研究重点之一。间充质干细胞在牙齿发育及组织再生过程中起着重要的作用，牙齿发育异常包括数目、形态、结构异常，这些都与牙齿发育过程中的基因表达及功能异常相关，从而引起发育过程中细胞特别是干细胞增殖分化的功能变化导致疾病的发生。近年来，间充质干细胞和组织工程技术的研究进展给牙齿或牙周组织再生带来了希望。间充质干细胞，具有多向分化潜能和自由更新的能力，可以分化成相应的组织。尽管间充质干细胞介导的牙及支持组织再生取得了一些研究成果，但目前还存在一些关键问题亟待解决，其中之一是再生的种子细胞-牙源性干细胞来源有限，牙源性干细胞定向分化及增殖的分子调控机制仍未完全明确。干细胞可以进行异体移植用于治疗，但由于供者年龄和其他一些因素的影响，有些干细胞过于衰老，治疗效果欠佳，并且由于成人干细胞生命周期短暂导致其长期治疗效果较差。如果对干细胞进行遗传改建，使其重编程，激活或抑制调节衰老过程的基因，使干细胞重新年轻，从而给与他们新的生命；或者提高干细胞的定性分化能力及延长其生命周期后再用于治疗，从而提高干细胞的治疗效果。尽管很多研究表明间充质干细胞异体移植后具有免疫抑制作用，但都缺乏长期的追踪报道。长期的异体移植有可能存在的排异反应、伦理及其他一些因素的影响，使病人难以接受。用病人自己的干细胞在体外进行培养的过程中，进行遗传改建，使其干细胞恢复正常的功能，特别是对于某些遗传病的病人，揭示其疾病的致病机理，一方面有助于疾病的早期诊断、预防及治疗；另一方面可以针对性地对他们的干细胞采取激活异常沉寂的基因或者沉寂异常激活的基因，从而使改建以后的，具有多潜能的干细胞用于自体移植具有广阔的临床应用价值。SFRP2是一个可溶性的WNT信号调节因子SFRPs基因家族的一员。SFRPs基因家族定位于染色体8p12～11.1，包括5个成员：SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4和SFRP5，属于分泌型frizzled相关蛋白，作为可溶性的Wnt信号调节因子，通过与Wnt信号通路同源的受体竞争结合而抑制Wnt信号通路，从而在生物发育、细胞转运、肿瘤形成及细胞凋亡等生命过程中发挥重要的作用。此外SFRP2还可以抑制RANKL的活性从而抑制破骨细胞活性，并与Tolloid金属蛋白酶结合来调节胶原形成，或者与integrin和fibronectin复合体相互作用调控细胞凋亡。目前研究表明SFRP2是间充质干细胞本身分泌的一个重要因子，在间充质干细胞的自我更新过程中起着重要调节作用，并且可以增强骨髓间充质干细胞心肌修复效果。但SFRP2对间充质干细胞定向分化的影响及机制尚不清楚，需要进行深入研究。通过SFRP2对间充质干细胞功能影响的研究，可以为研究间充质干细胞的程序性再激活及功能改建进行理论准备，在此基础上希望能发现相应的药物或生物制剂控制干细胞的状态来达到临床应用和治疗的目的，解决患者的痛苦，恢复患者的身心健康，并将产生较好的经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的应用，为了实现本专利技术的目的，拟采用如下技术方案。本专利技术提供了SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用。本专利技术还提供了SFRP2作为制备促进牙源性间充质干细胞介导组织再生药物的应用。本专利技术所述的药物按照加工需要可以制备成任何医药上可接受的剂型，其配置通常由本领域技术人员公知的加工方法制备，即将活性组分与液体溶剂或者固体载体混合，在添加至少一种表面活性剂制备而成，其中较优选为片剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊剂。本专利技术所述的药物在使用前可由使用者经稀释或直接使用。本专利技术的有益效果为通过对WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化的机制进行的研究，发现其有促进干细胞牙向-骨向分化的左右，并对其可能的机制进行阐述，从而为研究牙齿和骨骼生长发育时空特异性的分子调控机制及生物性全牙再生的种子细胞的改建提供重要线索。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实
施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示早期成骨分化碱性磷酸酶指标；a为碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶；b为测茜素红染色检测晚期成骨指标-细胞矿化能力；c为测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力；d～i为0d、3d、7d、10d、14d周的不同时间点收获细胞；图2示过表达SFRP2促进SCAPs成骨/成牙本质分化能力；图3示基因敲除SFRP2抑制SCAPs成骨/成牙本质分化能力；图4示SFRP2敲除的根尖牙乳头干细胞变化；图5示碱性磷酸酶检测及茜素红染色的方法观察到SCAPs的成骨分化能力；a为碱性磷酸酶检测；b为茜素红染色。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。以下实验方法在未进行特殊说明的情况下均为本领域常规技术手段。干细胞的分离、培养与鉴定：人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙牙周组织和恒牙炎性牙周组织，牙髓组织,或者正畸需要拔除的年轻恒牙(正畸减数拔牙或年轻智齿)根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和培养PDLSCs，DPSCs，SCAPs，简述如下：将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷PBS的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养牙周膜干细胞、牙髓细胞、根尖牙乳头细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取中段的牙周组织，磨开牙髓腔、取出牙髓，或直接切取根尖牙乳头部位组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90、CD146、STRO-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。构建病毒质粒：应用Whitehead研究所的程序设计SFRP2的SiRNA，插入慢病毒载体上构建成SFRP2shRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
SFRP2在制备促进牙源性间充质干细胞成骨和/或成牙分化的药物或制剂中的应用。

【技术特征摘要】
2015.05.14 CN 20151024673041.SFRP2在制备促进牙源性间充质干细胞成骨和/或成牙分化的药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：范志朋，王松灵，于国霞，王劲松，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京口腔医院，
类型：发明
国别省市：北京;11