【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及原代上皮细胞培养领域，具体地涉及腮腺上皮细胞培养物及其培养方法和应用。
技术介绍
1、腮腺是人体三大唾液分泌器官之一，其主要功能是分泌唾液。腮腺疾病种类较多，涵盖炎症、损伤、肿瘤、舍格伦综合征和放射损伤等，其中放射损伤和舍格伦综合征对腮腺功能破坏最为严重，患者口干明显，极大地影响了生活质量，需要深入研究解决唾液腺放射损伤以及舍格伦综合征这类严重的临床问题。
2、腮腺是上皮器官，主要有浆液性上皮细胞和导管上皮细胞两种细胞类型，其上皮细胞在体内基本不分裂，处于静息状态，浆液性腺泡上皮细胞和导管上皮细胞均为高度分化的细胞，细胞平均寿命周期超过三个月，其自我更新有丝分裂速率较低。因此，在体外培养腮腺组织来源的原代上皮细胞十分困难。关于腮腺的研究主要用动物模型进行实验，包括小型猪、小鼠和大鼠，这些动物与人类存在物种差别，只能模拟人的腮腺研究。已有的成品上皮培养基无法满足腮腺细胞培养需求。腮腺细胞研究常用的唾液腺上皮细胞系是日本科学家miyazaki从人颌下腺导管上皮分离培养建系的，但是该细胞系可能存在hela污染，严重影响研究结果的准确性。综上，目前没有理想的腮腺原代上皮细胞培养体系，限制了与腮腺相关的在机制方面上的深入研究。
3、
技术介绍
中的信息仅仅在于说明本专利技术的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供腮腺上皮细胞培养物及其培养方法
2、本专利技术的第一方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其包括以下步骤：
3、(1)使腮腺组织在分离培养基中培养得到腮腺原代上皮细胞；
4、(2)使腮腺原代上皮细胞在条件培养基中进行培养；和
5、(3)将步骤(2)的得到的细胞进行传代继续培养；
6、其中，所述分离培养基为含血清的dmemf12培养基，所述条件培养基以不含血清的dmemf12为基础培养基，同时添加包含egf、fgf2、胰岛素、bpe、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子。
7、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，基于所述条件培养基，所述egf的含量为0.01-0.05μg/ml，所述fgf2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述bpe的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
8、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述腮腺组织为来源于人的腮腺组织。
9、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述方法包括：取正常腮腺组织用pbs去除血污后，剪碎得到组织块，随后用i型胶原酶和中性金属蛋白水解酶消化，弃掉消化酶后，先用含血清的dmemf12培养基培养，待上皮细胞爬出后，换条件培养基进行上皮细胞的培养，常规换液，细胞融合至80％-90％时胰蛋白酶消化传代。
10、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，进一步包括对步骤(3)继续培养后的细胞进行形态分析和类型鉴定的步骤。
11、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述类型鉴定包括检测作为标志物的角蛋白5、钠钾氯协同转运蛋白和/或激肽释放酶血管舒缓素的步骤。
12、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其中，所述步骤(1)得到的腮腺原代上皮细胞包括腺泡上皮细胞和导管上皮细胞，且不包含成纤维细胞。
13、本专利技术的第二方面，提供用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基，其以不含血清的dmemf12为基础培养基，同时添加包含egf、fgf2、胰岛素、bpe、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子，其中：
14、所述egf的含量为0.01-0.05μg/ml，所述fgf2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述bpe的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
15、本专利技术的第三方面，提供腮腺上皮细胞培养物，其包含通过第一方面所述的方法培养得到的混合细胞。
16、本专利技术的第四方面，提供第三方面所述的腮腺上皮细胞培养物在唾液腺及相关疾病研究中的应用。
17、本专利技术所用的方法能成功培养人腮腺原代上皮细胞，并能有效传代多达15以上，所用的培养基配方可以稳定的对人腮腺原代上皮细胞扩增培养、传代，从而成功建立行之有效的人腮腺原代上皮细胞培养体系，可为唾液腺相关疾病研究提供细胞模型，从而可进行深入机制的研究探索，为腮腺发育、再生、类器官培养、干细胞鉴定以及腮腺相关疾病等的研究提供良好的基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，基于所述条件培养基，所述EGF的含量为0.01-0.05μg/ml，所述FGF2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述BPE的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述腮腺组织为来源于人的腮腺组织。
4.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：取正常腮腺组织用PBS去除血污后，剪碎得到组织块，随后用I型胶原酶和中性金属蛋白水解酶消化，弃掉消化酶后，用含血清的DMEMF12培养基培养，待上皮细胞爬出后，换条件培养基进行上皮细胞的培养，常规换液，细胞融合至80％-90％时胰蛋白酶消化传代。
5.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，进一步包括对步骤(3)
6.根据权利要求5所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述类型鉴定包括检测作为标志物的角蛋白5、钠钾氯协同转运蛋白和/或激肽释放酶血管舒缓素的步骤。
7.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)得到的腮腺原代上皮细胞包括腺泡上皮细胞和导管上皮细胞，且不包含成纤维细胞。
8.用于培养腮腺原代上皮细胞的培养基，其特征在于，以不含血清的DMEMF12为基础培养基，同时添加包含EGF、FGF2、胰岛素、BPE、氢化可的松和转铁蛋白的活性因子，其中：
9.腮腺上皮细胞培养物，其特征在于，其包含通过权利要求1-7任一项所述的方法培养得到的混合细胞。
10.根据权利要求9所述的腮腺上皮细胞培养物在唾液腺及相关疾病研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，基于所述条件培养基，所述egf的含量为0.01-0.05μg/ml，所述fgf2的含量为0.01-0.05μg/ml，所述胰岛素的含量为1-30μg/ml，所述bpe的含量为10-90μg/ml，所述氢化可的松的含量为0.1-1μg/ml，所述转铁蛋白的含量为0.05-0.5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述腮腺组织为来源于人的腮腺组织。
4.根据权利要求1所述的用于培养腮腺原代上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：取正常腮腺组织用pbs去除血污后，剪碎得到组织块，随后用i型胶原酶和中性金属蛋白水解酶消化，弃掉消化酶后，用含血清的dmemf12培养基培养，待上皮细胞爬出后，换条件培养基进行上皮细胞的培养，常规换液，细胞融合至80％-90％时胰蛋白酶消化...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓宇，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京口腔医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。