本发明专利技术公开了一种基于巢式复合COLD‑PCR联合测序的T790M突变检测方法。该方法以待测样本核酸为模板，利用SEQ ID NO.1~4和SEQ ID NO.5~8所示的引物组进行巢式复合COLD‑PCR联合测序。巢式复合COLD‑PCR包括外反应和内反应，外反应是COLD‑PCR与常规PCR反应的组合反应，内反应是常规PCR反应。该方法具有很好的突变检测灵敏度、检测下限和重复性，而且可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果，还可通过调整外反应的循环数比，根据需要调整突变富集效果和检测灵敏度，具有非常好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于巢式复合COLD?PCR联合测序的T790M突变检测方法。该方法以待测样本核酸为模板，利用SEQ ID NO.1~4和SEQ ID NO.5~8所示的引物组进行巢式复合COLD?PCR联合测序。巢式复合COLD?PCR包括外反应和内反应，外反应是COLD?PCR与常规PCR反应的组合反应，内反应是常规PCR反应。该方法具有很好的突变检测灵敏度、检测下限和重复性，而且可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果，还可通过调整外反应的循环数比，根据需要调整突变富集效果和检测灵敏度，具有非常好的应用前景。【专利说明】一种基于巢式复合COLD-PCR的T790M突变检测方法
本专利技术属于基因检测
更具体地，涉及一种基于巢式复合⑶LD-PCR联合 测序法的EGFR基因T790M突变检测方法及其试剂盒。
技术介绍
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR_TKIs)已广泛应用于非小细胞肺癌患者的抗肿瘤革巴向 治疗，其疗效的获得有赖于患者是否存在EGFR基因酪氨酸激酶编码区突变，因此，在靶向治 疗前先检测EGFR基因突变状态，对于患者选择与疗效预测具有重要意义。然而所有接受 EGFR-TKIs靶向治疗有效的非小细胞肺癌患者最终将出现继发耐药，其中近半数的继发耐 药患者会出现EGFR基因二次T790M突变。T790M突变位于EGFR基因20外显子上与EGFR-TKIs 耐药相关。当存在T790M突变时，EGFR与ATP的亲和力增强从而相对削弱了其与EGFR-TKIs的 亲和力，故而导致耐药。目前，EGFR基因T790M二次突变是第一个被公认的EGFR-TKIs获得性 耐药机制。相关研究显示T790M突变不仅存在于EGFR-TKIs治疗后的患者肿瘤细胞中，还可 能以微克隆的形式存在于EGFR-TKIs治疗前的肿瘤组织中，EGFR-TKIs治疗使这些克隆被选 择性富集。因此，利用高灵敏度的检测方法尽早的检出微量T790M突变对非小细胞肺癌患者 EGFR-TKIs治疗的疗效和耐药预测具有重要意义。 目前，临床应用的T790M基因突变检测方法主要包括直接测序法、突变扩增阻滞系 统（amplification refractory mutation system，ARMS)等。其中直接测序法是突变检测 的"金标准"方法，其不仅能检测已知与未知突变，还能明确具体的突变类型，但是灵敏度偏 低限制了直接测序法的应用范围，其仅能检出突变片段比例大于20%样品中的突变，由于临 床送检的肿瘤组织其肿瘤细胞含量各异，当使用如直接测序法等灵敏度较低的方法进行突 变检测时会造成微量T790M突变的漏检。而ARMS法虽然灵敏度较高，但其试剂昂贵、存在非 特异性扩增曲线且仅能检测已知突变限制了其应用范围。 综上所述，EGFR基因T790M突变与非小细胞肺癌患者EGFR-TKIs靶向治疗疗效预测 和耐药相关，灵敏的检出微量T790M突变对指导非小细胞肺癌靶向治疗具有重要意义。常规 PCR联合测序法虽是突变检测的金标准方法，但仅能检出突变片段比例> 20%的突变的低灵 敏度限制了其临床应用。另外，C0LD-PCR法于2008年被首次报道，其可简单快捷的富集突变 片段，与其他方法联用可有效提高突变的检出效率。C0LD-PCR可分为全C0LD-PCR和快速 C0LD-PCR，其基本原理为：在野生型、突变型混合样品体系中野生与突变型DNA片段形成的 杂合双链较完全匹配的同源双链的Tm值低，另有一些突变可导致其所在DNA片段的Tm值下 降;利用此种情况，在相应的PCR反应程序中设定一个较低的临界变性温度(即Tc值)可使仅 杂合双链或Tm值降低的纯合突变双链才能有效变性而野生型纯合双链不能有效变性从而 选择性的扩增突变片段实现突变富集。其与传统直接测序法的联合应用不仅可有效提高突 变检测效率还简便经济，因此具有重要的实用价值。故建立一个高灵敏度的C0LD-PCR直接 测序体系检测T790M突变具有良好的应用前景。 然而，目前C0LD-PCR法还有以下几个问题还亟待解决：（l)COLD-PCR的原理决定了 其对特定杂合或突变模板的选择性扩增，同时野生型模板的扩增受到抑制，其对野生型样 品的扩增效率低下;然而在临床样品检测时，样品的突变状态是未知的，临床要求不但能灵 敏的检出低浓度突变也能正常检出野生型样品；同时，T790M突变所在的20外显子还存在插 入突变等其他类型突变，有效检测T790M突变的同时也能正常检出其他突变类型也是基本 需求之一;所以如何能保证T790M突变的有效富集又不影响野生型或其他突变型样品的成 功检测和检出，是研究的一大重点和难点。（2)检测灵敏度和准确度是一对矛盾，对一个方 法而言在不同的应用情况下其对灵敏度和准确度要求是不一样的。那么C0LD-PCR对突变的 富集程度是否可控，以满足不同的应用情况?也即C0LD-PCR的灵敏度是否可以人为调整以 适应不同的应用需求?是研究的另一大重点和难点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有T790M基因突变检测方法的缺陷和不足，建 立一种高灵敏度且突变富集效果可控的C0LD-PCR直接测序T790M突变检测体系，其不仅可 提高样品的T790M突变检出率还不影响野生型样品和其他类型突变样品的检测和检出。 本专利技术的目的是提供一种基于巢式复合C0LD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突 变检测方法。 本专利技术另一目的是提供一种依据上述方法构建的基于巢式复合C0LD-PCR联合测 序法的EGFR基因T790M突变试剂盒。 本专利技术上述目的通过以下技术方案实现： 一组基于巢式复合C0LD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测引物组，所述引物 组包括外引物对和内引物对;所述外引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO. 1~2 所示;所述内引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.3~4所示。 优选地，上述外引物对的Tc值为89.7 °C。 进一步地，所述引物组还包括外测序引物对和内测序引物对;所述外测序引物对 的前向引物和后向引物分别如SEQ ID N0.5~6所示，所述内测序引物对的前向引物和后向 引物分别如SEQ ID N0.7~8所示。 一种基于巢式复合⑶LD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测方法，是以待 测样本核酸为模板，利用上述引物组进行巢式复合C0LD-PCR联合测序;所述巢式复合C0LD-PCR包括外反应和内反应，所述外反应是利用上述外引物对进行C0LD-PCR与常规PCR反应条 件的组合反应，所述内反应是利用上述内引物对进行常规PCR反应。具体优选地，所述外反应程序如下： 预变性:94°C 3min; 第一循环阶段:94°C 30s、58°C 30s、72°C 45s，共5个循环； 第二循环阶段:89.7°C 30s、58°C 30s、72°C 45s，共B个循环； 第三循环阶段:94°C 30s、58°C 30s、72°C 45s，共C个循本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组基于巢式复合COLD‑PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物对和内引物对；所述外引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.1~2所示；所述内引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.3~4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗凯，贺智敏，王倩，张志杰，郑国沛，仇秦威，刘浩，邱霓，
申请(专利权)人：广州医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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