一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，将假坚强芽孢杆菌(Bacilluspseudofirmus)的L-丙氨酸脱氢酶活性中心附近73位赖氨酸通过PCR定点突变为丙氨酸，构建突变体表达载体，通过原核表达及Ni-NTA亲和层析技术纯化得到突变体酶K73A。所获得的突变体酶K73A之比活力是野生型的202%，而其他酶学性质没有变化。突变体酶蛋白对底物L-丙氨酸的转换数Kcat为376.7min-1，对β-NAD+的转换数Kcat为290.1min-1，分别是野生型的2.0和2.1倍。可用于改善生物法生产丙酮酸及L/D-丙氨酸等的生产工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程

技术介绍
L-丙氨酸脱氢酶(L-alanine dehydrogenase, Aid, EC1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶。L-丙氨酸脱氢酶可逆催化L-丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨以及NADH。反应如下所示:L-alanine + NAD+ + H2O <->NH4+ + pyruvate + NADH + H+ L-丙氨酸脱氢酶是参与调节氨基酸和糖代谢的重要酶类，催化反应的产物丙酮酸或L-丙氨酸广泛应用于医药、农药、食品等领域，具有良好的发展前景。如将该酶与丙氨酸消旋酶共同作用，则可将丙酮酸、氨等 最终生成D-丙氨酸。因此，L-丙氨酸脱氢酶在医药、农药及食品等领域具有重要的应用价值。L-丙氨酸脱氢酶广泛存在于微生物之中，最初是由Wiame等人于1955年发现，但直到1990年其编码基因才由Kuroda等人被克隆。目前已经从超嗜热古菌 Archaeoglobus fulgidus,细长聚球藻 Synechococcus elongatus PCC794本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L?丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示2.一种编码权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。3.一种制备权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列，在与结构已解析同源蛋白的二级结构序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；所述突变引物对为5 ' - TCTTTAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠建松，徐书景，赵宝华，何广正，李兵杰，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：