一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法及其应用。本方法使用XAmide酰胺柱，在待测样品前处理过程中采用乙醇：异丙醇(1:4)混合有机溶剂高效的减少待测样品中的乳糖干扰，优化检测条件，有效的分离了酶水解产物中葡萄糖和半乳糖及其差向异构体，并建立线性回归方程，对检测样品中的低聚半乳糖进行准确定量。本发明专利技术方法简单易行，大大降低前处理时间和成本；线性范围宽，具有干扰少、检出限低、精确度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法及其应用
本专利技术属于保健食品检测领域，具体涉及一种采用Xamide酰胺色谱柱测定奶粉、米粉和乳米粉中的低聚半乳糖含量的方法及其应用。
技术介绍
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种活性低聚多糖，是以乳糖为底物，在具有半乳糖基转移活性的β-半乳糖苷酶作用下，首先将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，然后再将半乳糖转移到半乳糖分子上生成低聚半乳糖。一般情况下，低聚半乳糖的分子结构是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1～7个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n为0-6)，分子量约300-2000。低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，能促进肠内益生菌群如双歧杆菌、乳酸菌的增殖，同时促进肠胃蠕动，改善肠道功能，预防便秘；能改善钙铁锌等矿物质的吸收，防止骨质疏松，降低龋齿发病率；能改善脂类的代谢，降低血脂和胆固醇。因此，目前常作为一种新的功能性食品广泛应用于饼干、馅饼、面包、果酱、发酵乳、饮料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等多种食品加工业。不仅如此，低聚半乳糖还被成为母乳化的益生元，成为婴幼儿食品的配方之一。然而，由于低聚半乳糖属于一类低聚杂糖，该分离检测技术一直是当前研究的难点和重点。目前还没有固定的低聚半乳糖的标准品，不能直接测定其含量。因此，只能通过酶水解使低聚半乳糖转化为半乳糖的方式来计算低聚半乳糖的含量，即用水解后半乳糖的总量减去游离的半乳糖含量和无水乳糖水解产生的半乳糖含量，从而根据公式计算出待测样品中低聚半乳糖的含量。根据相关文献报道，检测保健食品中的低聚半乳糖含量广泛应用的方法一般是采用糖柱、氨基柱或凝胶柱去分离GOS经酶水解后的产物，并通过高效液相色谱(HPLC)结合蒸发光散射检测器(ELSD)或示差折光检测器(RID)检测半乳糖。但是，保健食品中的成分较多，特别是高乳糖含量的奶粉、米粉及其混合物的酶水解产物如葡萄糖和半乳糖就具有多种旋光异构体，均属于大极性化合物，出峰时间接近，严重干扰了GOS的定量检测。因此，常规的分离液相柱均难以实现对这类化合物的有效分离，而且一般用来分离大极性化合物的氨基柱的稳定性较差。另外，对于乳糖和半乳糖含量高的样品，乳糖和蔗果三糖的出峰时间相似，影响乳糖的出峰；根据检测原理，如果样品中乳糖含量过高，即低聚半乳糖含量和乳糖含量之比小于1:10的乳制品，例如配方奶粉，检测的误差就会加大，这个缺点也是AOAC方法不能弥补的。综上所述，如何有效的分离低聚糖酶水解产物中葡萄糖、半乳糖及其多种旋光异构体，成了米粉、奶粉及其混合产品中低聚半乳糖定量分析的瓶颈，并且有效去除高乳糖含量乳制品中的乳糖干扰，这也是本专利技术重点解决的问题。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术提供了一种测定奶粉、米粉及其混合产品中低聚半乳糖含量的方法，该方法操作方便，能准确定量待测样品中的低聚半乳糖含量，所述混合产品包括乳米粉。本专利技术的测定方法采用酰胺色谱柱在高效液相色谱-蒸发光散射检测器上进行。所述方法包括以下检测步骤：(1)提取和去除杂多糖干扰：称0.5g样品于50mL离心管中，加入纯水，用醋酸溶液调节pH至4～5，溶解振荡5min；加入杂多糖沉淀剂，振荡5-10min后，10000r/min离心，用定量滤纸过滤后得到澄清滤液，滤液低压浓缩至干，得到浓缩物；(2)降低乳糖对结果的干扰：往所述步骤(1)中所得到的浓缩物中加入异丙醇-乙醇混合有机试剂，涡旋振荡5min，过滤，取滤渣，如此重复五次，滤渣低压浓缩至干获得浓缩物；(3)制备酶解前待测液：将所述步骤(2)中得到的浓缩物用水定容至5ml，得待测样品溶液；取1mL过0.22μm滤膜至进样瓶中；(4)制备酶解后待测液：取所述步骤(3)中的待测样品溶液2mL加入0.2mL的β-半乳糖苷酶，酶解，酶解后取1ml过0.22μm滤膜于进样瓶中；(5)往空白样品中添加不同浓度水平的半乳糖标准品和乳糖标准品，建立所述半乳糖和所述乳糖的线性回归方程，确定线性范围，并且进行方法学考察验证；(6)测定：在配备有蒸发光散射检测器的岛津LC-20AT系列高效液相色谱上，选择酰胺色谱柱，以乙腈-甲醇作为流动相，设置柱温和进样量，分别检测所述步骤(3)制备的酶解前待测液和所述步骤(4)制备的酶解后待测液，并记录对应的半乳糖和乳糖的峰面积；(7)计算：先通过线性回归方程，计算酶解前后待测样品中的半乳糖含量以及乳糖含量，再用酶解后半乳糖的总量减去游离的半乳糖含量和乳糖酶解产生的半乳糖含量，经过公式计算出检测样品中低聚半乳糖的含量。优选的，所述步骤(1)中的杂多糖沉淀剂为乙醇；所述乙醇的体积与所述步骤(1)中加入的纯水的体积的比例为4：1。优选的，所述步骤(2)中的异丙醇和乙醇的体积比为4：1。优选的，所述步骤(4)中的β-半乳糖苷酶活度为2000U/mL；酶解温度为55℃；酶解时间为0-6h。优选的，所述步骤(5)中的半乳糖标准品和乳糖标准品设置为6个浓度水平，分别为500、800、1000、2000、4000和8000mg/kg。优选的，所述步骤(6)中的酰胺色谱柱为华普XAmide色谱柱，4.6mm×250mm×5.6um；流动相乙腈和甲醇的体积比为50～80：50～20；柱温为30℃；进样量为2～10μL。优选的，所述步骤(7)中的公式为GOS＝k*(GB-GA-GL)；其中，公式中GB为酶解后半乳糖的含量；GA为游离态半乳糖的含量；GL为乳糖酶解所产生半乳糖含量，为乳糖含量除以换算系数1.9；k为半乳糖转换成GOS的换算系数，k＝(180+162n)/(180*n)；所述换算系数k为1.49。本专利技术使用的XAmide酰胺柱是一种亲水作用色谱柱，具有结构独特的中性酰胺键合相，亲水性突出，使用高比例的乙腈/水或缓冲盐做流动相可以保留在传统的反相色谱柱上很难保留的强极性化合物。相较氨基键合相和无键合相，Xamide的中性键合相较氨基键合相和无键合相纯硅胶具有更高的稳定性。与现有技术相比，本方法采用XAmide酰胺柱作为分离色谱柱，稳定有效地分离低聚半乳糖的酶水解产物半乳糖和葡萄糖及其差向异构体等强极性物质；本专利技术方法操作简单、快捷、有效，能准确定量奶粉、米粉及其混合产品中低聚半乳糖的含量，线性范围宽，具有干扰少、检出限低、精确度高等优点，可以广泛应用于食品检测领域中乳制品低聚半乳糖的含量。附图说明图1是分离低聚半乳糖异构体的液相图，流动相为乙腈-甲醇＝51:49(v/v)；图2是半乳糖标准品在0min，12min，24min，2h，240h不同溶解时间的液相图；图3是葡萄糖标准品在0min，12min，2h不同溶解时间的液相图；图4是有效分离半乳糖和葡萄糖的重合液相图，流动相为乙腈-甲醇＝51：49(v/v)；图5是分离半乳糖和葡萄糖的液相图，流动相为乙腈：水＝70：30(v/v)；图6是不同进样体积下葡萄糖、半乳糖和乳糖的分离液相图；图7是奶粉样品在酶解0min、18h和28h后的检测液相色谱全景图，流动相为乙腈：甲醇＝51：49(v/v)；图8是米粉样品在酶解0min、30min、1.5h、3h、6h和9h后的检测液相色谱全景图，流动相为乙腈：甲醇＝51：49(v/v)；图9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法，其特征在于，所述方法采用酰胺色谱柱在高效液相色谱‑蒸发光散射检测器上进行测定。

【技术特征摘要】
1.一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法，其特征在于，所述方法采用酰胺色谱柱在高效液相色谱-蒸发光散射检测器上进行测定，所述方法包括以下检测步骤：(1)提取和去除杂多糖干扰：称0.5g样品于50mL离心管中，加入纯水，用醋酸溶液调节pH至4～5，溶解振荡5min；加入杂多糖沉淀剂乙醇，振荡5-10min后，10000r/min离心，用定量滤纸过滤后得到澄清滤液，滤液低压浓缩至干，得到浓缩物；(2)降低乳糖对结果的干扰：往所述步骤(1)中所得到的浓缩物中加入异丙醇-乙醇混合有机试剂，涡旋振荡5min，过滤，取滤渣，如此重复五次，将滤渣低压浓缩至干获得浓缩物；(3)制备酶解前待测液：将所述步骤(2)中的浓缩物用水定容至5ml，得待测样品溶液；取1mL过0.22μm滤膜至进样瓶中；(4)制备酶解后待测液：取所述步骤(3)中的待测样品溶液2mL加入0.2mL的β-半乳糖苷酶，酶解，酶解后取1ml过0.22μm滤膜于进样瓶中；(5)往空白样品中添加不同浓度水平的半乳糖标准品和乳糖标准品，建立所述半乳糖和所述乳糖的线性回归方程，确定线性范围，并且进行方法学考察验证；(6)测定：在配备有蒸发光散射检测器的岛津LC-20AT系列高效液相色谱上，选择酰胺色谱柱，以乙腈-甲醇作为流动相，设置柱温和进样量，分别检测所述步骤(3)制备的酶解前待测液和所述步骤(4)制备的酶解后待测液，并记录对应的半乳糖和乳糖的峰面积；(7)计算：先通过线性回归方程，计算酶解前后待测样品中的半乳糖含量以及乳糖含量，再用酶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦晓群，易蓉，王志元，郑璇，刘青，杜斯航，翁文川，吴志航，黄维龙，张玉文，梁瑞婷，张英鹏，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44