一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法。通过制备二硫化钼/石墨烯和金纳米颗粒的复合材料，构建了金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯适体传感器，并且基于适体识别的“signal‑on”模式，建立了灵敏检测溶菌酶的新方法。溶菌酶的线性检测范围为10‑14‑10‑8M，最低检测限为6.9×10‑15M。实际样品的测定结果表明，该方法具有很好的适用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电化学检测
，具体涉及一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法。
技术介绍
溶菌酶(lysozyme),又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一类专门水解微生物细胞壁的酶的总称，因其具有溶菌的生化特性而得名。溶菌酶可溶于水，水溶液澄清透明，不溶于有机溶剂。其分布广泛，存在于各类生物的不同组织中。它能够选择性地溶解微生物的细胞壁，因而在医疗上可用来抗菌、消炎和预防伤口感染，并且对其他组织器官无影响，是一种对生物体本身没有毒副作用的蛋白质。另外，在食品领域溶菌酶还可以用来防腐保鲜，在畜牧业中可以增强家养动物的抗病力。溶菌酶在人类血清和尿液中的浓度异常与许多疾病相关，如癌症、艾滋病和骨髓白血病。由于溶菌酶重要的生理特性，开发新的、快速、有效的方法对溶菌酶的检测具有重要意义。到目前为止，报道了许多检测溶菌酶的方法，如电化学、表面增强拉曼光谱、比色法、荧光等方法。其中，电化学适体传感器检测溶菌酶的方法引起了广泛的研究兴趣。电化学传感技术具有检测成本低、分析速度快、灵敏度高、操作方便、易于实现自动化和实时监测等显著优点。电化学适体传感器是以核酸适体作为分子识别元件，根据适体与目标分析物配体结合前后电化学信号的变化来进行分析检测的电化学生物传感器。适体识别元件与各种电化学转换器的组合选择配用，决定着电化学适体传感器对目标物检测的选择专一性、灵敏性和检测精度。电极材料的选择，对于提高传感器的灵敏度至关重要。现有技术已经公开了多种针对溶菌酶的电化学适体传感器及其检测方法。如郭等(Y.J.Guo,Y.J.Han,Y.X.Guo,C.Dong,Biosens.Bioelectron.,2013,45,95-101)报道了采用具有电化学活性的染料(橙II)修饰石墨烯，制备了石墨烯橙II复合纳米片的免标记适体传感平台，检测溶菌酶的线性范围是5.0×10-12-7.0×10-10M，检出限为1.0×10-12M。陈等(Z.B.Chen,J.X.Guo,J.Li,L.Guo,RSCAdv.,2013,3,14385-14389)构建基于金纳米晶体放大的电化学适体传感器检测溶菌酶，线性范围1×10-13M-1×10-8M，检测限为1×10-13M。虽然现有技术已经公开了多种电化学适体传感器及相应检测方法，但对于溶菌酶的检测，如何提高其检测灵敏度，仍是本领域技术人员的关注热点。
技术实现思路
在现有技术的基础上，专利技术人通过研究，制备了二硫化钼/石墨烯和金纳米颗粒的复合材料，构建了金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯适体传感器，并且基于适体识别的“signal-on”模式，建立了灵敏检测溶菌酶的新方法。二硫化钼/石墨烯复合材料拥有较高的比表面积和较好的生物相容性，金纳米颗粒与二硫化钼/石墨烯通过金硫键自组装结合，形成金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯复合材料，构建的金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯的适体传感器在溶菌酶的检测中表现出优良的电化学性能。具体的，本专利技术涉及以下技术方案：首先，本专利技术提供一种溶菌酶电化学适体传感器的制备方法，包括如下步骤：1)采用L-半胱氨酸法制备二硫化钼/石墨烯(MoS2/GR)复合材料；2)制备金纳米(AuNPs)颗粒；3)制备金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料(AuNPs/MoS2/GR)溶液；4)溶菌酶报告探针-适体双链(DNAduplex)的制备：亚甲基蓝(MB)修饰的溶菌酶报告探针(P-MB)：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-MB-3’与溶菌酶适体(A-Lys)：5’-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG-3’组装成双链DNAduplex；5)适体传感器的制备：玻碳电极预处理后，将AuNPs/MoS2/GR滴涂在玻碳电极电极(GCE)表面，得到金/二硫化钼/石墨烯/裸玻碳(AuNPs/MoS2/GR/GCE)修饰电极；将制备的AuNPs/MoS2/GR/GCE电极浸在溶菌酶报告探针-适体双链溶液中，培育制得溶菌酶电化学适体传感器。本专利技术所述适体传感器，首先，将AuNPs/MoS2/GR复合材料修饰在GCE表面。MoS2/GR形成三维的导电网络，具有大的比表面积、良好的导电性和化学稳定性，大的比表面积可以增加电子的传输速率及测定灵敏度；通过可控制备得到的金纳米颗粒(10-13nm)，可通过金硫键与MoS2/GR自组装形成复合材料，防止了金纳米颗粒的聚沉，提高了金纳米颗粒的稳定性；MoS2/GR大的比表面积也有利于负载较多的金纳米粒子，从而可进一步提高适体传感器电极的导电能力和灵敏度，且AuNPs/MoS2/GR复合材料具备良好的生物相容性。其中，本专利技术采用先分别制备两种材料(MoS2/GR和AuNPs)，然后在搅拌的情况下通过金硫键自组装的方式将两者材料复合在一起的优势在于：既能可控得到想要的直径位于10-13nm的金纳米颗粒，该纳米尺度对整体传感器的灵敏度最佳，又能使得AuNPs均匀的分布在MoS2/GR三维的导电网络中，防止了AuNPs的团聚，也可负载较多的AuNPs(如图1)。若是先把MoS2/GR修饰在到玻碳电极上再滴涂AuNPs,AuNPs不仅容易团聚并且只是分布在MoS2/GR的表面且不均匀，导致传感器的灵敏度下降。此外，本专利技术所述适体传感器为“Signal-on”标记型电化学适体传感器，是建立在DNAduplex与溶菌酶特异性反应后导致溶菌酶报告探针发生结构转换，使得电活性小分子标记物(亚甲基蓝)从远离电极表面变成靠近电极表面，从而增强了电子传递能力，增大了检测信号。具体为，溶菌酶报告探针和溶菌酶适体部分互补形成双链，溶菌酶报告探针通过其一端(5’)的硫醇键与AuNPs之间形成金-硫键从而使双链固定在电极上，报告探针另一端(3’)修饰的亚甲基蓝作为产生电信号物质；报告探针3’和5’端各有8个碱基可以互补配对，当溶菌酶存在时，溶菌酶与溶菌酶适体相结合，将适体从双链中脱离下来，单链的溶菌酶报告探针形成发夹形式，相比于直立的溶菌酶报告探针-适体双链，此时3’的亚甲基蓝与电极之间的距离拉近，电化学信号增强。具体的，本专利技术溶菌酶电化学适体传感器的制备方法，步骤1)中二硫化钼/石墨烯(MoS2/GR)的制备中，先制备氧化石墨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶菌酶电化学适体传感器的制备方法，包括如下步骤：1)采用L‑半胱氨酸法制备二硫化钼/石墨烯(MoS2/GR)；2)制备金纳米(AuNPs)颗粒，粒径为10‑13nm；3)制备金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯(AuNPs/MoS2/GR)复合溶液：将1mg MoS2/GR分散在1mL超纯水中，超声30min,接着加入1mL制备的AuNPs后避光震荡30min，制得AuNPs/MoS2/GR复合材料溶液。4)溶菌酶报告探针‑适体双链(DNA duplex)的制备：亚甲基蓝(MB)修饰的溶菌酶报告探针(P‑MB)：5’‑SH‑C6‑GTG CAG AGC TAA GTA ACT CTG CAC‑MB‑3’与溶菌酶适体(A‑Lys)：5’‑ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG‑3’组装成双链DNA duplex；5)适体传感器的制备：玻碳电极预处理后，将制备的AuNPs/MoS2/GR复合材料溶液滴涂在玻碳电极电极(GCE)表面，避光晾干，制得AuNPs/MoS2/GR/GCE；将制备的AuNPs/MoS2/GR/GCE电极浸在溶菌酶报告探针‑适体双链溶液中，培育制得溶菌酶电化学适体传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种溶菌酶电化学适体传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)采用L-半胱氨酸法制备二硫化钼/石墨烯(MoS2/GR)；
2)制备金纳米(AuNPs)颗粒，粒径为10-13nm；
3)制备金纳米颗粒/二硫化钼/石墨烯(AuNPs/MoS2/GR)复合溶液：将1mg
MoS2/GR分散在1mL超纯水中，超声30min,接着加入1mL制备的AuNPs后避
光震荡30min，制得AuNPs/MoS2/GR复合材料溶液。
4)溶菌酶报告探针-适体双链(DNAduplex)的制备：亚甲基蓝(MB)修饰的
溶菌酶报告探针(P-MB)：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTG
CAC-MB-3’与溶菌酶适体(A-Lys)：5’-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTT
ACTTAG-3’组装成双链DNAduplex；
5)适体传感器的制备：
玻碳电极预处理后，将制备的AuNPs/MoS2/GR复合材料溶液滴涂在玻碳电
极电极(GCE)表面，避光晾干，制得AuNPs/MoS2/GR/GCE；
将制备的AuNPs/MoS2/GR/GCE电极浸在溶菌酶报告探针-适体双链溶液中，
培育制得溶菌酶电化学适体传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，溶菌酶报告
探针溶解在100mMPBS中并暗处理1h打开二硫键，然后将10μM溶菌酶报告
探针加入到10μM溶菌酶适体溶液中，稀释所得溶液至浓度为1μM后加热至
90℃并持续5min，温度降至室温后在37℃下培育2h使双链形成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，玻碳电极的
预处理为：将在金相砂纸上打磨后的裸玻碳电极用0.3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宗花，鹿林，桂日军，张菲菲，金辉，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37