甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法及其应用。所述甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法包括将N,N,N‑三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中使其达到溶胀状态，再加入甘露吡喃异硫氰酸苯酯充分反应，通过乙醇洗涤抽滤减压干燥制得N‑甘露糖‑N,N,N‑三甲基壳聚糖。本发明专利技术还提供了甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法在制备载药微球制剂中的应用。本发明专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法制备条件温和，制备出的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂能靶向树突状细胞，克服黏膜屏障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及载药微球
，具体涉及一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法及其应用。
技术介绍
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。目前市场上使用的疫苗主要为减毒活疫苗，这种疫苗存在毒力逆转、引起不良反应及需要冰箱贮存和转运等问题。而通过重组DNA技术和化学合成抗原与多肽的这一类新一代的疫苗，虽然限制和避免了传统疫苗常有的副作用，但其免疫原性差、在低pH和酶等作用下会发生降解、吸收率低，单独使用无法产生有效的免疫保护反应等问题。因此，开发适用于新一代疫苗的传递系统是非常必要的。壳聚糖是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有生物相容性和生物可降解性，对皮肤和黏膜无刺激，有抗菌、提高巨噬细胞吞噬能力等多种作用。壳聚糖能介导暂时开放紧密连接的细胞，增强蛋白在黏膜表面的吸收，且壳聚糖可刺激免疫细胞增殖细胞因子，壳聚糖微粒被认为是具有前景的疫苗传递系统。三甲基壳聚糖(N-trimetylchitosan,TMCS)是壳聚糖三甲基化季铵衍生物，具有与壳聚糖相似的优点。相较于壳聚糖，TMCS不管在酸性还是在中性、碱性环境中都携正电荷，具有良好的溶解性，能够更好地促进药物吸收；另外对黏膜具有粘附性，能增加药物与黏膜的接触时间。树突状细胞通常分布于与外界接触的皮肤(黏膜)部位，主要为皮肤和鼻腔、肺、胃与肠的内层，他们被活化时，会移至淋巴组织中与T细胞与B细胞互相作用，以刺激与控制免疫反应，是目前所发现功能最强的专职抗原提呈细胞。树突状细胞可伸展其树枝结构并穿过上皮细胞摄取抗原，而甘露糖受体是树突状细胞膜表面高表达受体，在较短的时间内即可内化大量负载抗原，并诱导免疫应答反应。因此甘露糖受体对抗原的加工、处理和提呈以及效应T细胞的激活过程中扮演着重要角色。所以，如果能够以甘露糖残基修饰疫苗传递系统，则有望选择性提高树突状细胞对疫苗的摄取率、提高靶向效率，降低毒副作用。
技术实现思路
为了解决上述通过重组DNA技术和化学合成抗原与多肽的疫苗免疫原性差、在低pH和酶等作用下会发生降解、吸收率低的问题，本专利技术提供一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法及其应用，具有制备条件温和，甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂对树突状细胞靶向性高，能克服黏膜屏障的优点。本专利技术提供一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法，包括以下步骤：a、将N,N,N-三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中，搅拌并使其成溶胀状态；b、将甘露吡喃异硫氰酸苯酯作为甘露糖修饰物溶于步骤a中的有机溶剂中，并与N,N,N-三甲基壳聚糖于室温下搅拌反应，制得反应液；c、将步骤b制得的反应液加入到乙醇中，抽滤；d、用乙醇洗涤经步骤c抽滤得到的固体，减压干燥，得到N-甘露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖，所述N-甘露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖即为甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，在上述步骤a中所采用的N,N,N-三甲基壳聚糖由分子量为20kDa-1000kDa的壳聚糖制得。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，所述有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的任意一种或多种组合。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，所述N,N,N-三甲基壳聚糖的季铵化程度为20-40％。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，所述甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体中所述甘露吡喃异硫氰酸苯酯的取代度为5-15％。本专利技术还提供一种基于上述任一项所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法所制备的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。本专利技术还提供一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂，其粒径为0.3-8μm，包括药物、载体及交联剂，所述药物与载体的质量比为1:1-5倍，交联剂与载体的质量比为1:2-20倍，所述载体为权利要求1所制备的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂的一种较佳实施例中，所述药物为抗原蛋白或病毒疫苗。在本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂的一种较佳实施例中，所述交联剂为三聚磷酸钠、海藻酸钠及十二烷基硫酸钠中的任意一种或多种组合。本专利技术还提供一种基于上述任一项所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体和药物共同溶于去离子水中，配制成药物溶液，其中所述甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的浓度为0.5-10mg/mL，所述药物的浓度为0.1-2mg/mL；步骤二、将交联剂溶于去离子水中，配制成交联剂溶液，其中所述交联剂的浓度为0.1-2mg/mL；步骤三、在磁力搅拌下，将步骤二中制得的交联剂溶液加入到步骤一中制得的药物溶液中，加入完毕后搅拌20-60min，制得反应液；步骤四、将步骤三中制得的反应液冷冻离心，收集沉淀，洗涤，干燥，即得甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂，其中冷冻离心的温度为4℃，转速为8000-20000rpm。相较于现有技术，本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法及其应用具有以下有益效果：一、本专利技术在甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的合成中，使用有机溶剂代替水为溶剂，解决了甘露吡喃异硫氰酸苯酯易在反应过程中水解的问题，提高了反应效率；且反应后处理简单，未反应的甘露吡喃异硫氰酸苯酯在乙醇中可溶，而反应产物在乙醇中不溶，方便将杂质除去。二、在甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体添加甘露糖修饰物，使得甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体具有免疫细胞靶向作用和诱导免疫应答反应作用。三、利用N,N,N-三甲基壳聚糖，使的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体具有增强药物跨膜转运和细胞旁转运的能力，可提高生物利用度，同时能提高药物活性，替代免疫佐剂。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是本专利技术提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、将N,N,N‑三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中，搅拌并使其成溶胀状态；b、将甘露吡喃异硫氰酸苯酯作为甘露糖修饰物溶于步骤a中的有机溶剂中，于室温下搅拌反应，制得反应液；c、将步骤b制得的反应液加入到乙醇中，抽滤；d、用乙醇洗涤经步骤c抽滤得到的固体，减压干燥，得到N‑甘露糖‑N,N,N‑三甲基壳聚糖，所述N‑甘露糖‑N,N,N‑三甲基壳聚糖即为甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。

【技术特征摘要】
1.一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
a、将N,N,N-三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中，搅拌并使其成溶
胀状态；
b、将甘露吡喃异硫氰酸苯酯作为甘露糖修饰物溶于步骤a中的
有机溶剂中，于室温下搅拌反应，制得反应液；
c、将步骤b制得的反应液加入到乙醇中，抽滤；
d、用乙醇洗涤经步骤c抽滤得到的固体，减压干燥，得到N-甘
露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖，所述N-甘露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖即为
甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。
2.根据权利要求1所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备
方法，其特征在于，在步骤a中所采用的N,N,N-三甲基壳聚糖由分
子量为20kDa-1000kDa的壳聚糖制得。
3.根据权利要求1所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备
方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和
N-甲基吡咯烷酮中的任意一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备
方法，其特征在于，所述N,N,N-三甲基壳聚糖的季铵化程度为20-40％。
5.根据权利要求1所述的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备
方法，其特征在于，所述甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体中所述甘露吡
喃异硫氰酸苯酯的取代度为5-15％。
6.一种基于权利要求1～5中任一项所述的甘露糖接枝三甲基壳
聚糖载体的制备方法所制备的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐蓓华，胡英，
申请(专利权)人：浙江医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：浙江;33