本发明专利技术提供了一种铜绿假单胞菌重组蛋白POP及其制备方法和应用，由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白PcrV片段、铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通过连接肽(linker)连接形成的重组蛋白，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段‑(Linker A)m‑OprI片段‑(Linker B)n‑PilA片段；其中，所述Linker A和Linker B序列分别独立地选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个；m和n分别独立地取值为1、2、3或4。本发明专利技术还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。利用本发明专利技术的重组蛋白制备的亚单位疫苗可激发机体产生高滴度IgG抗体，可用于诊断、预防或治疗药物的制备。
【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌重组蛋白POP及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术制药领域，涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白POP，本专利技术进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内，该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染，机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织，如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。此外，由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。中国CHINET2005--2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0％、42.8％、35.8％、30.5％、30.5％、30.8％、29.1％和29.1％，对美罗培南的年度耐药率分别为32.0％、34.1％、28.5％、24.5％、25.2％、25.8％、25.0％和27.1％，但其中泛耐药(PDR-PA)菌株数量显著增多，在2011年和2012年分别达到1.8％和1.5％(铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识，中华结核和呼吸杂志，2014年1月37卷1期)。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫，从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择。基因工程亚单位疫苗通过基因工程的手段，将病原体的致病因子或其突变体的基因克隆至的蛋白表达载体，重组子在工程菌内进行大规模表达，经过纯化后制备成基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等有点，已成为疫苗研发的重要方向。研发基因工程疫苗的关键是筛选到良好的保护性抗原分子。铜绿假单胞菌的III型分泌系统是由20多个蛋白质组成的注射器样的大复合物，能够将一些毒力因子(如ExoU、ExoS、ExoY、ExoT等)及其它效应蛋白直接注入宿主细胞，引起宿主细胞损伤从而在细菌感染性疾病中发挥重要作用。PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(TeiiiS.等，CriticalCare2014)。鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。抗PcrV的多克隆抗体、单克隆抗体都能够抑制III型分泌系统的分泌，保护机体受到铜绿假单胞菌的入侵(Sawa，T.等.NatMed1999，Milla，C.E.等PediatrPulmonol2014，Frank，D.W.等JInfectDis2002，Baer，M.等InfectImmun2009。同样PcrV也是重要的候选疫苗分子，但由于其本身能够形成同源多聚体等原因，目前还未见有可溶性重组表达该蛋白单体的报道。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outermembranelipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。OprI蛋白在铜绿假单胞菌中高度保守，已经有研究将其作为铜绿假单胞菌的诊断靶点(Saint-OngeA等JGenMicrobiol.1992，DeVosD等JClinMicrobiol.1997，QinX等JClinMicrobiol.2003)。虽然OprI仅含有83个氨基酸，但是OprI具有良好的免疫原性和免疫保护性。OprI单独运用或与其它保护性抗原联合应用时能够诱导有效的免疫应答，有效抵抗铜绿假单胞菌的感染(Baumann，U.等Vaccine2004，Knapp，B.等Vaccine1999，Mansouri，E.等InfectImmun1999，Toth，A等.Vaccine1994，vonSpecht，B.U等.，InfectImmun等1995，vonSpecht，B.U等.，Vaccine1996，Weimer，E.T.等，Vaccine2009，Weimer，E.T.等，InfectImmun2009，Westritschnig，K等.HumVaccinImmunother2014)。鉴于OprI的这些性质，该蛋白可以作为良好的基因工程疫苗候选抗原。PilA蛋白为铜绿假单胞菌的IV型菌毛，在细菌的运动，与宿主细胞的粘附以及在组织的主动入侵过程中发挥重要作用(HahnHP.Gene1997.)。在肺炎动物模型和角膜炎动物模型上发现PilA蛋白的缺失导致其侵袭力和毒力明显下降(HazlettLD等，CurrEyeRes1991)。同时抗pilA的抗体能够抑制铜绿假单胞菌与上皮细胞的粘附(DoigP，等，Infect.Immun.1990)。重组表达的PilA蛋白免疫小鼠后能够有效的激发细胞免疫应答和体液免疫应答，并在烧伤感染模型中具有部分的保护效果(KorpiF等，JMicrobiolBiotechnol.2015)。这些资料显示PilA是一个良好的保护性抗原。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在研究中发现，将铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)通过连接肽与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白(OprI)连接形成的重组蛋白激发机体产生更好的识别铜绿假单胞菌的抗体，有利于铜绿假单胞菌的诊断和治疗。为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案：一种重组蛋白，所述重组蛋白由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白PcrV片段、铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通过连接肽(linker)连接形成，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段-(LinkerA)m-OprI片段-(LinkerB)n--PilA片段(POP)；其中，所述LinkerA和LinkerB序列分别独立地选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；m和n分别独立地取值为1、2、3或4，优选为1。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段的氨基酸序列为SEQIDNO：3。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(OprI)的片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段的氨基酸序列为SEQIDNO：5。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述重组蛋白是由核苷酸序列为SEQIDNO：1的DNA编码的。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码权利要求1～6所述的重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体；更优选为p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白PcrV片段、铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通过连接肽(linker)连接形成，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段‑(Linker A)m‑OprI片段‑(Linker B)n‑‑PilA片段；其中，所述Linker A和Linker B序列分别独立地选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；m和n分别独立地取值为1、2、3或4，优选为1。
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白PcrV片段、铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通过连接肽（linker）连接形成，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段-(LinkerA)m-OprI片段-(LinkerB)n--PilA片段；所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是由核苷酸序列为SEQIDNO:1的DNA编码的。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码权利要求1所述的重组蛋白的核苷酸序列形成。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体。5.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵莉群，顾江，章金勇，邹全明，杨峰，杨茜，彭六生，吴翼，王逸麟，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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