本发明专利技术提供一种融合蛋白SUMO3-PLA2及制备方法，本发明专利技术还提供了该SUMO3化融合蛋白的医用用途，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题；利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO3-PLA2，克服现有方法中PLA2 蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种融合蛋白SUM03-PLA2及制备方法，本专利技术还提供了该SUM03化融合蛋白的医用用途，属于生物
技术介绍
SUMOCSmall ubi quit in-re lated modifier)即小泛素相关修饰物，是一种新发现的广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰形式，在生命活动中发挥着重要的作用。在体内SUMO化修饰所起的作用包括调节蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在核与质的相互转运以及对细胞周期的调控等。由于SUMO化修饰的底物蛋白都是一些非常重要的细胞周期调控蛋白，如p53，PML和RanGAPl等，因此SUMO化与去SUMO化过程在细胞内发挥着非常重要的生物学功能，制备出高灵敏的底物及分析方法是进行相关研究的关键。磷脂酶A2(ph0Sph0lipaSe A2, PLA2)是参与细胞代谢活动、信号转导等过程的重要酶类之一，广泛分布于哺乳动物机体内。磷脂酶是指催化水解磷脂酰、溶血磷脂酰化合物中的羧酸酯键、磷酸酯键和磷酸与胆碱之间酯键的一类脂酶。PLA2可催化水解细胞膜甘油磷脂类的sn-2位酯键从而生成脂肪酸和溶血磷脂。花生四烯酸是其中重要的一种，介导体内一系列病理生理过程，如机体的抗菌抗病毒过程、关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、血栓形成等。近期研究还发现，PLA2与巴特综合征、神经轴突营养障碍、新生儿坏死性小肠结肠炎等疾病均具有密切关系。磷脂酶A2中有大量的二硫键，这可能影响了其在大肠杆菌中的有效表达，另外，目前磷脂酶A2在大肠杆菌中多以包涵体形式表达，对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前PLA2蛋白的体外有效表达、纯化是PLA2蛋白应用过程的难点。因PLA2能水解甘油磷脂类的sn-2位酯键的特点，许多人工sn-2位连接荧光基团的脂类是PLA2活性的方便灵敏的产物，但PLA2的活性受其N端序列空间位阻的影响，利用此特点，本专利技术鸡的SUM03分子融合于PLA2的N端，应用原核表达纯化出SUM03-PLA2蛋白，此时融合的PLA2无水解底物活性，当去SUMO化酶水解除去PLA2的N端SUM03分子解除空间位阻，使PLA2活性，水解人工脂类底物，从而用来分析去SUMO化酶的活性。
技术实现思路
本专利技术公开一种融合蛋白SUM03-PLA2，克服了 PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题。本专利技术进一步提供了SUM03化融合蛋白的制备方法，利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUM03-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。本专利技术又提供了SUM03化融合蛋白的医用用途，在体外系统中检测去SUMO化酶活性，并且公开了此蛋白作为去SUMO化酶底物的使用方法。本专利技术的目的在于提供一种利用pColdTF表达载体高效表达PLA2蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的SUMO融合的PLA2蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳；本专利技术提供一种SUM03-PLA2融合基因的获取方法;本专利技术进一步提供了融合蛋白SUMOl-PLA2的原核表达质粒的构建、融合蛋白SUM03-PLA2的原核表达、纯化及功能验证等详细方法;此外还应用融合蛋白SUM03-PLA2分析去SUM03化酶的活性。本专利技术所述的一种融合蛋白SUM03-PLA2，其特征在于: 其的氨基酸序列如SEQ n0.1所示。本专利技术所述的融合蛋白SUM03-PLA2的制备方法，包括以下步骤: 1)鸡SUM03基因的获取 提取鸡全基因组;PCR法扩增SUM03基因序列;所用引物为: 上游引物:CATATG ATGTCG GACCAG GAAGCA AAG下游引物:ACCGGT CTGTT CCTGAT AAACTTC 以鸡全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到鸡SUM03基因，如图1所示； 2)鼠源性PLA2基因的获取 提取小鼠基因组;PCR法扩增PLA2基因序列;所用引物为: 上游引物:ACCGGT GGAGGA CTCCTG GAGCT下游引物:CTCGAG TCAATT GCACTT GGGAGA GTC 以小鼠全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到PLA2基因，如图2所示； 3)SUM03-PLA2融合蛋白基因全长的构建 SUM03基因PCR扩增后产物经双酶切(NdeI和AgeI)和PLA2基因PCR扩增产物经双酶切(AgeI和XhoI)后，凝胶回收双酶切产物;pColdTF表达质粒双酶切(NdeI和XhoI)后，凝胶回收大片段;将上述三个回收片段连接，获得将融合蛋白全长基因构建入PColdTF表达载体中的重组质粒，既融合蛋白原核表达质粒pColdTF-SUM03-PLA2;其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUM03-PLA2; 4)融合蛋白TF-SUM03-PLA2的制备将融合蛋白原核表达质粒TF-SUM03-PLA2导入到BL2UDE3)原核表达菌体系，37°C终浓度0.1 mM IPTG诱导表达载体蛋白；非变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白。本专利技术所述的融合蛋白在作为去SUMO酶底物的用途 用来作为人、哺乳动物及鸟类去SUM03化酶的活性分析。应用去SUMO化酶SENPl对融合蛋白TF-SUM03-PLA2进行了成功的酶切分离，见图4;通过去SUMO化酶水解SUMO与PLA2间的肽键释放PLA2，再由PLA2水解带有荧光基团的价格低廉的脂类底物NBDC6-HPC，可以产生一种荧光底物NBD，通过检测荧光强度分析去SUMO化酶的水解活性，此信号逐级放大过程可提高检测的灵敏度，见图5。本专利技术的积极效果在于:提供了一种新的SUM03化融合蛋白，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题;利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUM03-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。【附图说明】图1为1%琼脂糖凝胶电泳显示SUM03基因片段的调取；图2为1%琼脂糖凝胶电泳展示融合蛋白PLA2基因的获取；图3为10% SDS-PAGE电泳图展示Ni亲和层析后的融合蛋白TF-SUM03-PLA2。图4为去SUMO化酶SENPl对融合蛋白的酶切；图5为对PLA2水解NBDC6-HPC产生荧光的监测。【具体实施方式】通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术。下面用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1基因扩增与融合融合基因SUM03-PLA2全长的获取: 1、鸡SUM03基因的获取，步骤如下:检索鸡SUM03基因全序列(来源于NCBI核酸数据库)； 鸡SUM03核酸序列1ATGTCGGAGGAGAAGCCCAAGGAAGGAGTGAAGACAGAGAACGACCACATCAACCTGAAGGTGGCCGGGCAGGATGGCTCCGTCGTGCAGTTCAAGATCAAGCGGCACACGCCTCTCAGCAAGCT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白SUMO3‑PLA2，其特征在于：其的氨基酸序列如SEQ no.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：艾永兴，于佩峰，邓晨，吴山力，郑海南，王梦云，赵程程，郝林琳，于浩，张玉静，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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