液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，该方法包括：向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，向上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，过HLB固相萃取柱，收集洗脱液，浓缩，用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液溶解，过滤，得待测液；配制标准混合工作溶液系列；将标准混合工作溶液系列和待测液在液相色谱串联质谱条件下分别进样，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测液中相应非蛋白含氮化合物含量。本发明专利技术能用于同时检测地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种的含量，准确度高，灵敏性强。

【技术实现步骤摘要】
液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法
本专利技术涉及一种乳制品中非蛋白含氮化合物含量的检测方法，具体涉及液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法。
技术介绍
乳制品是人类最古老的天然饮料之一，由于其营养丰富、容易消化吸收、物美价廉、食用方便，因此也被称为“白色血液”。乳制品中最受人青睐的当属牛奶和牛奶制品了。伴随着对牛奶营养价值的认可度不断提高，人们对其消费需求也不断增长，对其质量要求也越来越高。牛奶含氮量一直是判定牛奶质量的一个重要指标，以凯氏定氮法为代表的测定方法可以实现对样品中粗蛋白含量的测定。但该方法只能测出含氮量而无法区分氮的来源，使得非蛋白氮掺假无法得到有效控制，不合格产品特别是掺假乳制品严重危害了人体健康，其中以三鹿的三聚氰胺事件最为突出，2012年新西兰乳品巨头恒天然也在其产品中检测发现部分奶制品中存在双氰胺残留。目前已经发现的非蛋白含氮化合物通常具有相对无味，无色和食之无味等特点，食品生产者通常不会故意使用高毒性的化合物来进行掺假，然而，如三聚氰胺事件，即使是相对无毒的化学物质也可能会导致不可预见的对健康造成无法挽回的负面影响。因此一些国家和地区对食品中非蛋白含氮化合物的使用情况进行了明确规定：美国和欧盟规定畜产品中环丙氨嗪最高残留量为0.05mg/kg，2002年我国农业部《动物性食品中兽药残留最高限量》中规定环丙氨嗪在禽产品中最高残留限量为0.05mg/kg，在羊肌肉、脂肪、肝、肾中的最高残留限量0.3mg/kg。2011年规定乳制品中三聚氰胺的限量要求：婴幼儿配方乳粉1mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉2.5mg/kg，含乳15％以上的其他食品2.5mg/kg。在三聚氰胺事件和双氰胺被发现后，研究人员对其三聚氰胺、双氰胺及其类似物的测定方法展开系列的研究，分别开发了使用分光光度法，红外光谱法，气相色谱-质谱法，高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法的检测技术对其进行测定，我国制定系列检测标准(例如：GB29704-2013，GB/T22388-2008，SN/T3032-2011)，实现对其检测技术的标准化。但这些检测所涉及的化合物数目相对比较单一。随着人们食品安全意识的提高，按照传统的分析方法和思维，需要较长的检测周期，较多的人力和物力，检测成本高，不能满足目前化合物种类不断增加，分析通量不断提高的需求。同时也容易出现在发生突发事件后再被动应对展开检测的情况发生(例如三聚氰胺事件)。因此残留的检测范围需要从单一检测发展为多种化合物的同时定性与定量分析。
技术实现思路
本专利技术提供了一种液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，该方法解决了现有技术对非蛋白含氮化合物检出数目单一的问题。液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，包括以下步骤：(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺至少两种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；其中，液相色谱条件为：色谱柱：WatersXBridgeHILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；②3.0min：50％A，50％B；③8.0min：50％A，50％B；④9.0min：10％A，90％B；⑤20.0min：10％A，90％B；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；电喷雾电压：3500V；离子源温度：250℃；干燥气温度：高纯氮气，250℃；干燥气流量：高纯氮气，16L/min；雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；鞘气温度：高纯氮气，350℃；鞘气流量：高纯氮气，10L/min；质谱参数为：⑥地昔尼尔：定量离子对为191.1/150.0，碰撞能量为21；定性离子对为191.1/109.1，碰撞能量为31；⑦双氰胺：定量离子对为85.1/68.1，碰撞能量为20；定性离子对为85.1/43.1，碰撞能量为22；⑧缩二脲：定量离子对为104.2/61.0，碰撞能量为9；定性离子对为104.2/44.1，碰撞能量为37；⑨环丙氨嗪：定量离子对为167.2/85.1，碰撞能量为20；定性离子对为167.2/125.1，碰撞能量为18；⑩三聚氰胺：定量离子对为127.1/85.1，碰撞能量为19；定性离子对为127.1/68.1，碰撞能量为36。本专利技术能用于检测地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种非蛋白含氮化合物的含量，并且以S/N等于10计，对牛奶样品中各非蛋白含氮化合物的测定定量限可达：地昔尼尔0.5μg/kg，双氰胺2.5μg/kg，缩二脲20μg/kg，环丙氨嗪5μg/kg，三聚氰胺15μg/kg，准确度高，灵敏性强。本专利技术经蛋白沉淀、脱脂后，采用氨水乙腈配合HLB固相萃取进行净化。与乙腈相比，采用氨水乙腈不仅能提高待净化液在HLB固相萃取柱上的洗脱效率，还能提高回收率。而与QuEChERS净化技术以及其他固相萃取柱(如MCX、C18)相比，采用HLB固相萃取柱进行净化时，对五种非蛋白含氮化合物的回收率均能达到80％以上。本专利技术在综合考察乙腈，甲醇，0.15％甲酸水溶液，0.15％甲酸水溶液(含3～10mM乙酸铵)为定容溶液和流动相时的分离、谱峰峰形和强度等情况时发现，流动相为乙腈和0.15％甲酸水溶液(梯度洗脱)时，谱峰的峰形和强度最好，加入乙酸铵后可进一步明显提高各化合物的信号强度(其中地昔尼尔的信号强度提高近50倍)。研究发现，地昔尼尔谱峰峰形受到外界因素的影响较大，当定容溶液与流动相初始溶液一致时，地昔尼尔谱峰峰形较好，二者不一致则会出现“分叉”峰。因此步骤(3)中采用的定容溶液与流动相初始溶液相一致。作为进一步优选，所述三聚氰胺-15N3内标物的添加量为50～200ng；更优选为100ng。作为进一步优选，所述三聚氰胺-15N3内标物的质谱参数为：定性离子对为130.2/87.1，碰撞能量为19。作为优选，步骤(1)中，所述蛋白沉淀剂为乙腈。与常规的三氯乙酸和甲醇相比，采用乙腈作为蛋白沉淀剂时，既便于对后续的下清液进行快速浓缩，提高目标检测物的信号响应程度，又能对待测样品中的蛋白质实现较为彻底的沉淀，避免蛋白质残留影响检测结果。作为进一步优选，乙腈与待测样品的混合体积比为本文档来自技高网...

【技术保护点】
液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液‑乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；其中，液相色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge HILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；②3.0min：50％A，50％B；③8.0min：50％A，50％B；④9.0min：10％A，90％B；⑤20.0min：10％A，90％B；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；电喷雾电压：3500V；离子源温度：250℃；干燥气温度：高纯氮气，250℃；干燥气流量：高纯氮气，16L/min；雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；鞘气温度：高纯氮气，350℃；鞘气流量：高纯氮气，10L/min；质谱参数为：⑥地昔尼尔：定量离子对为191.1/150.0，碰撞能量为21V；定性离子对为191.1/109.1，碰撞能量为31V；⑦双氰胺：定量离子对为85.1/68.1，碰撞能量为20V；定性离子对为85.1/43.1，碰撞能量为22V；⑧缩二脲：定量离子对为104.2/61.0，碰撞能量为9V；定性离子对为104.2/44.1，碰撞能量为37V；⑨环丙氨嗪：定量离子对为167.2/85.1，碰撞能量为20V；定性离子对为167.2/125.1，碰撞能量为18V；⑩三聚氰胺：定量离子对为127.1/85.1，碰撞能量为19V；定性离子对为127.1/68.1，碰撞能量为36V。...

【技术特征摘要】
1.液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少四种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；其中，液相色谱条件为：色谱柱：WatersXBridgeHILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；②3.0min：50％A，50％B；③8.0min：50％A，50％B；④9.0min：10％A，90％B；⑤20.0min：10％A，90％B；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；电喷雾电压：3500V；离子源温度：250℃；干燥气温度：高纯氮气，250℃；干燥气流量：高纯氮气，16L/min；雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；鞘气温度：高纯氮气，350℃；鞘气流量：高...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯建波，谢文，张文华，李杰，陆顺，祝泽龙，姚滨滨，
申请(专利权)人：浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33