一种高耐受草甘膦的EPSP合酶及其应用制造技术

本发明专利技术从细菌中克隆到一种高耐受草甘膦的EPSP合酶，为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。通过实验证实了它具有高草甘膦耐受性；并且转入植物后，可导致植物对草甘膦耐受能力。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术设及一种5-締醇式丙酬莽草酷-3-憐酸合酶及其高耐受草甘麟除草剂的用 途。
技术介绍
： 草甘麟是世界上使用最广泛的除草剂品种之一。研究发现，草甘麟通过竞争性结 合EPSPS(5'-締醇式丙酬芒草酷-3-憐酸合酶)从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物无法合 成芳香族氨基酸及其衍生物，W及莽草酸积累，导致植物死亡。由于自然界中绝大部分植物 体内EPSP合酶均属于草甘麟敏感型，因此草甘麟除草剂具有十分优秀的广谱性。但是自然 界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多样性，部分微生物体内EPSP合酶对草甘 麟不敏感，利用基因工程技术将草甘麟不敏感EPSP合酶转入目标植物中W替代内源敏感型 EPSP合酶，将使该植物获得草甘麟除草剂抗性。 抗草甘麟转基因植物的研究开发对农业发展可起到巨大推进作用，而不同作物对 导入的EPSP合酶编码基因可能会产生不同的EPSP合酶表达能力，因此，为选育新的高抗草 甘麟的转基因作物，本领域迫切需要开发新的抗草甘麟的5-締醇式丙酬莽草酷-3-憐酸合 酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的5-締醇式丙酬莽草酷-3-憐酸合酶下亦简称为 巧PSP合酶"或巧PSPS")及获得该合酶的方法。[000引本专利技术的另一目的是提供编码该合酶的多核巧酸序列； 本专利技术的又一目的是提供所述合酶及其编码序列在提高植物对草甘麟耐受性方 面的用途。 本专利技术的第一方面，专利技术人从草甘麟污染±壤中分离一株高耐受草甘麟的细菌并 从该菌中克隆到高耐受草甘麟的EPSP合酶，为具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肤。 本专利技术人经过广泛而深入的研究，从细菌中分离获得了一种新的EPSP合酶，通过 实验证实了它具有高草甘麟耐受性，并且转入植物后，可导致植物对草甘麟耐受能力。 本专利技术的第二方面，提供了编码上述具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肤的 所述EPSP合酶的多核巧酸，所述多核巧酸的序列选自下组的一种： (a)具有沈Q ID NO: 1中1-1281位的序列； (b)具有沈Q ID NO: 1中1-1284位的序列。 本专利技术的第Ξ方面，提供了含有上述多核巧酸的载体，W及被该载体转化或转导 的宿主细胞或者被上述多核巧酸直接转化或转导的宿主细胞。 在本专利技术的第四方面，提供了制备所述EPSP合酶的多肤的方法，该方法包含：（a) 在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；（b)从培养物中分离出具有活性 的多肤。 在本专利技术的第五方面，提供了本专利技术多肤和编码序列的用途。 在本专利技术的第六方面，提供了一种改变植物抗草甘麟耐受性的方法，它包括步骤： (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所 述的6?5?合酶具有56〇10^:2氨基酸序列； (2)将植物细胞或组织或器官与步骤（1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编 码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上； (3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官； (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。 本专利技术的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。在本专利技术中，术语巧PSPS"、巧PSP合酶"、巧PSP合成酶"、巧PSP多狀'或"5-締醇式 丙酬莽草酷-3-憐酸合酶"可互换使用，都指具有5-締醇式丙酬莽草酷-3-憐酸合酶巧PSPS) 氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的蛋白或多肤。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。 本专利技术的多肤可W是重组多肤、天然多肤、合成多肤，优选重组多肤。本专利技术的多 肤可W是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例 如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本 专利技术的多肤可W是糖基化的，或可W是非糖基化的。本专利技术的多肤还可包括或不包括起始 的甲硫氨酸残基。 本专利技术还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生 物"和"类似物"是指基本上保持本专利技术的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肤。 本专利技术的多肤片段、衍生物或类似物可W是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肤，而运样的取代的氨基酸残基可W是也可W不是由 遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肤，或（iii)成熟多 肤与另一个化合物融合所形成的多肤，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肤序列而形成 的多肤(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肤的序列）。根据本文的教导，运些片段、衍 生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 在本专利技术中，术语巧PSP多肤"指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肤。该 术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。运些变异形式包括 但并不限于:一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个W内， 较佳地为10个W内，更佳地为5个W内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨 基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数 个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生 物。 该多肤的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、W及利用抗 EPSP多肤的抗血清获得的多肤或蛋白。本专利技术还提供了其他多肤，如包含EPSP多肤或其片 段的融合蛋白。除了几乎全长的多肤外，本专利技术还包括了EPSP多肤的可溶性片段。通常，该 片段具有EPSP多肤序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至 少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。 专利技术还提供EPSP合酶或多肤的类似物。运些类似物与天然EPSP多肤的差别可W是 氨基酸序列上的差异，也可W是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。运些多肤 包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可W通过各种技术得到。 在本专利技术中/'EPSP合酶保守性变异多肤"指与SEQ ID N0:2的氨基酸序列相比，有 至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨 基酸所替换而形成多肤。运些保守性变异多肤最好根据表1进行氨基酸替换而产生。[002引 表1 本专利技术的多核巧酸可W是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人 工合成的DNAdDNA可W是单链的或是双链的。DNA可W是编码链或非编码链。编码成熟多肤 的编码区序列可W与SEQ ID NO: 1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所 用，"简并的变异体"在本专利技术中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质，但与SEQ ID N0:1所 示的编码区序列有差别的核酸序列。 编码SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高耐受草甘膦的EPSP合酶，为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆伟，燕永亮，战嵛华，周正富，柯秀彬，张维，陈明，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11