一种造礁石珊瑚总RNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种造礁石珊瑚总RNA提取方法。它是将超低温保存的新鲜采集的造礁石珊瑚样本利用无菌海水冲洗其体表去除体表附着的其他生物，经液氮研磨后用异硫氰酸胍裂解液裂解，使得造礁石珊瑚的RNA释放游离于异硫氰酸胍裂解液中，然后再提取造礁石珊瑚总RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水。本发明专利技术方法实现了对造礁石珊瑚总RNA的高质量提取，最大限度的减少造礁石珊瑚RNA量的降解，可用于造礁石珊瑚基因克隆、差异显示分析、分子杂交等各种分子生物学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种造礁石珊瑚总RNA提取方法。
技术介绍
珊瑚礁是地球上的生物多样性最高生态系统之一，珊瑚礁生态系统不仅为人类的 生产和生活提供各种生物资源，而且具有巨大的生态功能和生态价值，对保障生物多样性、 生物生产力和生态平衡具有重要作用。然而近年来，世界范围内的珊瑚白化死亡现象日益 频繁，严重时导致珊瑚礁的退化。研究珊瑚白化机理不仅要了解珊瑚外在生理响应，更要深 入认识引起这些变化的内在分子机制。造礁石珊瑚的种类繁多，有七十多属。获取高质量 的造礁石珊瑚总RNA是进行分子机制研究的首要条件。RNA的质量好坏决定着可被反转录 为cDNA的最大序列信息，特别是对于体内生活着大量微生物及虫黄藻的复杂造礁石珊瑚 共生体。要获得大量完整、纯度高的总RNA，首先要清除珊瑚体内的虫黄藻、微生物等的影 响，其次要对造礁石珊瑚组织进行充分完全地破碎，还要抑制RNA酶的降解作用，从而获得 高质量的总RNA。目前常用的RNA提取方法多用于植物、动物组织的提取，并非适用于造礁石珊瑚， 且这些方法通常存在RNA得率和纯度较低的问题，难以进行下一步的分析。目前，尚无造礁石珊瑚总RNA提取方法的专利及其他文献资料。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决现有技术中没有适用于造礁石珊瑚的RNA提取方法的问 题，提供一种造礁石珊瑚总RNA提取方法；利用该方法提取的造礁石珊瑚RNA纯度高、质量 好，极大的减少了造礁石珊瑚RNA损耗和降低了DNA污染，能适用于后续RT-PCR等分子生 物学实验的要求。 本专利技术的造礁石珊瑚总RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和预处理、用裂 解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入异丙醇沉淀 RNA，弃上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚总RNA，其特征在于， 所述的造礁石珊瑚的采集和预处理是用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其 表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末； 所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA是将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍 裂解液裂解释放出RNA;所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38%的水饱和酚（酸性 水饱和酚，可以从试剂公司直接购买）、〇. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸钠和体 积分数为5%的甘油，其余为无RNA酶的水（RNase-free水）。 所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其具体步骤为： a、用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末， 得到造礁石珊瑚粉末； b、将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解，振荡混合，室温放置5min，4°C、 12000g离心5min，取上清液；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38 %的酸性水 饱和酚、0. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸钠和体积分数为5 %的甘油，其余为 RNase-free水； c、按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿， 摇荡混合，室温放置5min，4°C、12000g离心15-20min;离心后溶液分3层，取出上层水相， 按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀lOmin后12000g离心 lOmin;弃上清，加入余下溶液等体积的无水乙醇，混勾，4°C、7500g离心5min;弃上清，干燥 5-10min，得到造礁石珊瑚总RNA，将该RNA溶于RNase-freewater中-70~_80°C保存。 优选，所述的造礁石珊瑚为鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黄滨珊 瑚。 优选，所述的步骤a的无菌海水是经高温灭菌且经0. 22μ微孔滤膜过滤的海水。 用无菌海水冲洗造礁石珊瑚体表，是为了去除珊瑚体表的其它附着的生物对造礁石珊瑚 RNA提取的影响。 优选，所述的步骤b的造礁石珊瑚粉末与异硫氰酸胍裂解液用量比为3g:lml;此 比例下提取效果最佳，造礁石珊瑚过少会导致RNA浓度过低；造礁石珊瑚过多会导致裂解 不完全，内源性酶降解RNA严重。 优选，所述的步骤b和c的振荡混合为剧烈振荡15s。 优选，还包括以下步骤：在步骤c的按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在 步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4°C、12000g离心15-20min后，再重 复该操作2-3次；这样处理后沉淀去除蛋白质的效果更好。 用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前优选在低于_80°C环境下超低温保存，更优选 的，用干冰或液氮保存。这样保存效果更好、时间更长，RNA不易降解。材料的新鲜程度与 RNA提取的质量和得率有很大的关系，因此，在采样时要保证材料能够迅速超低温冻存，采 样时要尽可能带上液氮或干冰以保存材料。 本专利技术所用异硫氰酸胍裂解液对液氮研磨的粉末状造礁石珊瑚组织具有较好的 裂解效果，能够将造礁石珊瑚组织内含物充分破碎，使细胞在裂解液中充分裂解，减少由于 研磨不充分造成RNA产量的损耗。 利用本专利技术方法可以实现提取高质量的造礁石珊瑚RNA，并最大限度的减少造礁 石珊瑚RNA量的损耗和降低DNA污染；提取的RNA经RT-PCR后，可扩增出目的基因条带，且 条带清晰可见，大小与预想一致，测序结果与GenBank收录的序列相同，进一步证实了用该 方法提取的RNA质量和产量均达到了RT-PCR要求，可用于基因克隆、差异显示分析、分子杂 交等各种分子生物学研究。【附图说明】 图1为造礁石珊瑚RNA电泳图。 图2为造礁石珊瑚RNA反转录后得到的核糖体rRNA基因序列扩增产物电泳图。【具体实施方式】 以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。 实施例1: 2011年7月在三亚湾海域潜水采集鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚和澄黄滨珊瑚样 本，海水深度为l-5m，采样时使用液氮保存样品，以保证材料能够迅速超低温冻存。上述三 种造礁石珊瑚种类由中国科学院南海海洋研究所黄晖研究员鉴定。 用经高温灭菌且经0. 22μ微孔滤膜过滤的海水冲洗鹿角杯形珊瑚2-3次，以去除 鹿角杯形珊瑚体表的其它附着的生物；将研钵预冷，将鹿角杯形珊瑚表面的水吸干后，称取 3g左右的鹿角杯形珊瑚组织，在盛有液氮的研钵中磨成粉末。将研磨破碎的鹿角杯形珊瑚 组织粉末转移到干净的EP管，然后加入lmL异硫氰酸胍裂解液，剧烈振荡，室温放置5min， 4°C、12000g离心5min，取上清液。按上清液与氯仿体积比为5:1的量在上清液中加入氯仿， 剧烈摇荡15s，室温放置5min，4°C、12000g离心15min。离心后溶液分3层，取上层水相转 入新的EP管，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀lOmin后 12000g离心lOmin。弃上清，根据EP管中余下溶液等体积加入无水乙醇，混匀，4°C、7500g 离心5min。弃上清，干燥5-10min，得到鹿角杯形珊瑚总RNA。将该RNA溶于RNase-free water，得到鹿角杯形珊瑚总RNA溶液，保存于-70°C。所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积 分数为38 %的酸性水饱和酸、0. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸钠和体积分数为 5%的甘油，其余为RNa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造礁石珊瑚总RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和预处理、用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入异丙醇沉淀RNA，弃上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚总RNA，其特征在于，所述的造礁石珊瑚的采集和预处理是用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA是将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解释放出RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为无RNA酶的水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡思敏，许昌有，黄晖，刘胜，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44