本发明专利技术涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联后作为免疫原，免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体。该抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体，属 于植物病害防治领域。
技术介绍
由小麦光腥黑粉菌（Tilletiafoetida(Wallr. )Liro，TFL)引起的小麦光腥黑粉 病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植 物检疫性有害生物。此病菌孢子含量超过0.6%即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引 起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状（Goats, 1999 ;Hoffman，1982)，严重影响小麦品质及商 业价值。 小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难， 一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。 小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌的田间侵染症状以及孢子形态和颜色十分相 似，在田间观察时很难区分。目前，常用的鉴别方法是PCR反应或显微镜检测，但这两种方 法都需要用到仪器，只能在实验室内进行，并且PCR反应耗时长，工序复杂。因此，需要研发 一种简便、快速、准确的方法来鉴别小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌，从而采取相应的防 治措施，控制病害的进一步发展。
技术实现思路
为满足上述领域的需求，本专利技术提供一种抗体，该抗体能够特异识别小麦矮腥黑 粉菌，从而将小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌区别开来。 本专利技术请求保护的技术方案如下： -种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。 -种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利 要求1所述的半抗原进行改造和偶联，步骤如下： 取权利要求1所述的半抗原6mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取15mgEDC和NHS， 用0. 2mLPH5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B;称取牛 血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mLPH7. 2的0. 1MPBS中，将反应液B逐滴缓 慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天换 3次透析液；分装，保存于_20°C备用。 -种用于免疫方法鉴别小麦矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，对权利要求1 所述的半抗原进行改造和偶联，具体步骤如下： 取权利要求1所述的半抗原4mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取2. 5 %的戊二 醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B;称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在 3. 8mL0. 1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼 氢化钠还原反应2小时，然后在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分 装，保存于-20 °C备用。 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑的多克隆抗体，其采用以下步骤制备而 得： (1)以权利要求2所述的免疫原免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔； (2)对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体； 所述免疫包括多次，初次免疫0. 2mg/次/只，第二次开始0.lmg/次/只。 筛选产生高效价全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，进行竞争抑制检测试 验。 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步 骤：a、包板：将待测样品的孢子用抗原稀释液稀释200倍，混匀并加入酶标板，每孔各 100ul，37°C孵育2小时，洗板一次，拍干； b、封闭：每孔加入150ul封闭液进行封闭，37°C孵育2小时，弃液，拍干，备用； c、加抗体：用抗体稀释液将权利要求4所述的多克隆抗体稀释9000倍，每孔各加 入50ul，37°C孵育30分钟； d、洗涤：洗板3_5次，每次间隔30秒，拍干； e、加酶标二抗：加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体，每孔100ul，37°C孵育 30分钟； f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干； g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37°C孵育15分钟； h、终止：加入终止液终止反应；i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取0D值； 若0D值大小为1. 8~2. 0,则待测样品为小麦矮腥黑粉菌。 本专利技术提供的抗原蛋白，其氨基酸序列来自小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的 共有蛋白序列。采用所述抗原蛋白免疫实验动物，获得的抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉 菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦 矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。 本专利技术用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，操作十分简便，能够 快速、准确地判断待测样品是小麦矮腥黑粉菌。只需取疑似小麦矮腥黑粉菌的孢子与本发 明抗体在适当的反应条件下进行反应，如果出现抗原抗体反应，则该样品是小麦矮腥黑粉 菌，如果不能发生抗原抗体反应，则该样品是小麦光腥黑粉菌。整个过程无需仪器，技术人 员可以携带相关试剂和耗材，在野外就能完成两种黑粉菌的鉴别。【附图说明】 图1.多克隆抗体的制备流程图， 免疫时间安排：如表1所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第三 次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行 第五次免疫，7天后第三次采血检测，以此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。 其中，E004组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表2所 不。【具体实施方式】 下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，需要理解的是，下述实施例仅 作为解释和说明，而不以任何形式限制本专利技术的保护范围。 小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn):本专利技术所有的小麦矮腥黑 粉菌菌株为现有文献L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simple sequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionof TilletiacontroversaKUhn.FoliaMicrobiol. 55(3)，258 - 264(2010)所记载，参 见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记 载在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionand DiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu"hn.J 卩1171：(^31:11〇1159:155 - 158(2011)，为其中材料与方法部分记载的〇11313；^6〇3七68所提供 的TCK菌株。 小麦光腥黑粉菌：本专利技术所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌 萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999,03期（3) : 110-112所记载的菌株。 上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高利，沈慧敏，李超，陈万权，刘太国，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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