一种抗血管生成多肽[D-Ala制造技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成作用的多肽[D‑Ala

【技术实现步骤摘要】
一种抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种具有抗血管生成作用的多肽[D-Ala1]AS16。
技术介绍
血管生成是在原有血管内皮细胞的基础上形成新血管的自然过程。研究表明，实体瘤的生长依赖于新生血管生成，血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和营养物质，而且可以排泄代谢产物。抗肿瘤血管生成疗法具有很多优点：①具有高效性，破坏少量的血管可使依靠其生长的大量的肿瘤细胞发生缺血性坏死；②血管细胞无或少突变，不易产生耐药性，可长期用药；③广泛的抑瘤谱，不同肿瘤的血管内皮细胞往往表达相同的特异性蛋白分子，针对这种蛋白分子的一种疗法就可能适用于多种肿瘤；④药物易于到达靶细胞，血管内皮细胞直接暴露于血液中，药物能直接发挥作用。内皮细胞受体酪氨酸激酶VEGF-R2和Tie-2，及其配体血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素Ang1和Ang2，在血管生成中起着重要作用。通过封闭VEGF受体途径或者封闭Tie-2受体途径，都能抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，并且抑制VEGF受体传导途径不能被Tie-2传导途径所补偿，反之亦然，两个途径相对独立，且同样重要；即同时抑制由VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳定的能力。AS16作为一种由VEGFR2受体拮抗剂ATWLPPR（V1肽）和Tie2受体拮抗剂NLLMAAS（V2肽）通过柔性连接子（A-A）连接的多肽，在现有专利中已得到较为充分公开（CN101830971，一种新型抗肿瘤血管生成多肽）。但是作为一种多肽类药物，由于其分子量较小，在生物体内容易被酶降解，半衰期短，因而治疗效果容易受到较大影响，同时其对于抑制肿瘤新生血管生成的作用效果也存在进一步提升的空间。
技术实现思路
本专利技术主要目的是在现有AS16多肽基础上，通过对其研究改造，获得了一种新的多肽[D-Ala1]AS16，相较于原有的AS16多肽，新的多肽[D-Ala1]AS16在生物体内的半衰期得到了明显延长，而且抗肿瘤血管生成作用效果得到了明显提升。下面对本专利技术的技术方案详细介绍如下。一种抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16，含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如序列表SEQIDNO.1所示，具体氨基酸序列为：D-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即D-ATWLPPRAANLLMAAS；其中所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型；所述AS16为现有专利中已公开的（申请号：2010101722261，公开号：CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中为V3肽）多肽序列，与现有多肽序列相比，其主要区别在于在本申请中第一个氨基酸丙氨酸由L-构型替换为D-构型。所述抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16的制备方法，采用Fomc固相多肽合成法制备而成，过程为：首先将第一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基发生脱水缩合反应，形成肽键；重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割合成的多肽，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；经HPLC纯化后即可制得较高纯度的多肽样品。具体包括以下步骤：（1）溶胀树脂，于多肽合成仪中溶胀Wang树脂；（2）第一个氨基酸的添加，计算称取丝氨酸，同时按比例加入HOBT(1-羟基苯丙三唑）、DIC（N,N-二异丙基二亚胺）反应，反应结束后加封头液封头，洗涤；（3）第二个氨基酸即丙氨酸的添加，合成是从肽链的C端到N端方向进行，对步骤（2）中第一个氨基酸添加后树脂脱保护，洗涤，然后茚检，按比例加入第二个氨基酸丙氨酸、HOBT、DIC，反应，洗涤；（4）后续氨基酸的添加，添加的方法同上述第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；除了最后一个氨基酸改为D型丙氨酸，其他的氨基酸均为L型氨基酸；（5）多肽的切割，向步骤（4）中装有树脂的多肽合成仪中加入适量的脱保护液，洗涤；然后在通风橱中将配置好的切割试剂倒入合成仪中进行切割反应；切割完毕后，用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除；由于多肽序列中含有精氨酸，需再进行冰切；冰切完成后获得粗肽；粗肽烘干后利用RPHPLC纯化，纯化后产物首先于-80℃低温冰箱冷冻过夜，然后用冷冻干燥机冻干成白色粉末后于-20℃冰箱保存备用，即为所合成的多肽成品。所述抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16，在肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤例如H22肝癌所导致肿瘤。现有技术中，为延长多肽药物在生物体内半衰期，常用思路之一是以D构型氨基酸替换天然L构型氨基酸，从而降低酶对肽的降解作用，延长其半衰期。但不同构型氨基酸替换后，其生物活性的保留度及相应的作用效果则是未知的。本专利技术所提供的新的多肽[D-Ala1]AS16，相较于现有的AS16多肽，其结构差异主要在于第一个氨基酸构型的不同，而正是这一构型差异，使得本申请所提供的多肽[D-Ala1]AS16在进入生物体内时，不易被酶降解，具有更长的半衰期。同时，进一步的生物体活性实验证明，[D-Ala1]AS16多肽相较于现有的AS16多肽，同样地表现出了较好地通过抑制肿瘤新生血管生成从而抑制肿瘤的生长的效果，而且肿瘤抑制率及生物体存活期也得到了较为明显地改善；同时长期毒理实验结果表明，本专利技术所提供的多肽[D-Ala1]AS16虽然具有延缓动物体重增长的作用，但在恢复期结束后，动物体重恢复正常，对体重的影响只是该多肽药理效应的结果；因而总体而言，多肽[D-Ala1]AS16在未来肿瘤治疗药物的应用中表现出了较好地前景。附图说明图1为多肽AS16的质谱鉴定图；图2为多肽[D-Ala1]AS16的质谱鉴定图；图3为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16对Balb/c小鼠的生长曲线图；图4为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16对Balb/c小鼠的H22瘤重；图5为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16对Balb/c小鼠的抑瘤率；图6为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠的生长曲线图；图7为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠H22瘤重；图8为多肽AS16、多肽[D-Ala1]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠的抑瘤率；图9为H22肿瘤HE染色；图10为H22肿瘤CD31染色；图11为多肽AS16（b）、多肽[D-Ala1]AS16（a）对Balb/c小鼠生存期的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本专利技术中所用部分样品、药剂及仪器设备简要说明如下。实验试剂Fomc固相多肽合成中，Wang树脂和Fmoc保护的L型氨基酸及D型氨基酸均购于吉尔生化（上海）有限公司；细胞培养中，RPMI-1640培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗血管生成多肽[D‑Ala1]AS16，其特征在于，该多肽结构中含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如SEQ ID NO.1所示，具体氨基酸序列为：D‑Ala ‑Thr‑Trp‑Leu‑Pro‑Pro‑Arg‑Ala‑Ala‑Asn‑Leu‑Leu‑Met‑Ala‑Ala‑Ser；即D‑ATWLPPRAANLLMAAS；其中所述D‑Ala、D‑A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D‑构型。

【技术特征摘要】
1.一种抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16，其特征在于，该多肽结构中含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如SEQIDNO.1所示，具体氨基酸序列为：D-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即D-A...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁元明，高艳锋，吴春景，郭有泉，陈鲤翔，吴亚红，郝艳静，李国栋，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41