QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法技术

本发明专利技术涉及QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，包括：(1)将取回的土壤样品过网筛除去杂质，然后冷冻过夜；(2)采用FastDNATM SPIN Kit for Soil试剂盒提取土壤样品的总DNA；(3)以待测土壤样品的总DNA以及梯度稀释的阳性对照模板同时进行QPCR反应，得到土壤样品及阳性对照的扩增曲线和Ct值；(4)根据梯度稀释的阳性对照模板的扩增曲线和Ct值以及待测土壤样品的扩增曲线和Ct值，判断土壤样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。该方法通过冷冻处理土壤样品，改良DNA提取方法，能提取质量较好的DNA，解决了从土壤中难以提取DNA的困难，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及QPCR检测±壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，属于小麦矮腥黑粉菌防治 领域。
技术介绍
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletiacontroversa肺hn，TCK)引起的 重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难， 一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据化ffmann 报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20%~50%，最高可达75%~90%。除了 产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬抱子 而极大地影响品质。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种 植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在 栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2,其中冬小麦占绝 大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加 入WT0及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此， 必须加强小麦矮腥黑穗病的早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。 冬季小麦矮腥黑粉菌冬抱子潜藏在±壤中，定性定量检测±壤中小麦矮腥黑粉菌 冬抱子的含量，对于早期预警和预防病害，具有重要的意义，然而，小麦矮腥黑粉菌抱子体 积质量都非常小，而±壤中微生物种类多，分子生物学检测方法虽然灵敏度高，但是TCK的 DNA在±壤样品总DNA中的比例极低，而且TCK抱子的DNA提取率本身极低，常规方法提取 的±壤样品总DNA作为模板，容易导致假阴性结果。
技术实现思路
根据上述领域存在的需求，本专利技术提供一种QPCR检测±壤中小麦矮腥黑粉菌的 方法，该方法能够对±壤中的小麦矮腥黑粉菌进行定性和定量，有利于及时采取防治措施， 防止小麦矮腥黑穗病的发生。 本专利技术要求保护的技术方案如下： ±壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，提取DNA前对±壤进行冷 冻处理。 所述的±壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，采用细胞震荡破 碎仪W 6. 5M/S震荡2分钟对±壤样品进行处理。 还包括如下步骤： 所述冷冻处理之前，对±壤进行前处理：将取回的±壤样品过网筛除去杂质； 提取±壤样品的总DNA:采用FastDNA? SPIN Kit for Soil试剂盒，步骤如下： (1)称取5〇Omg±壤加到Lysing Matrix ETube中； (2)力日 978ulsodiumPhosphateBuffer到管中； (3)加 12化 1MT Buffer ; (4) 14000r/min离屯、10 分钟； (5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀； (6) 1400化/min离屯、5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管； (7)加入1ml充分混匀的Binding Matrix ; (8)满旋2分钟，让DM充分结合基质，满旋后将管放到管架上静置3分钟； (9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀； (10)重悬试管让Binding Matrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到Spin Filter中，14000r/min离屯、1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入Spin Filter中， 140(K)r/min离屯、1分钟，倒出流出液； 阳02U (11)加500ul的已加入无水乙醇的沈WS-M到Spin Filter中，利用水流重悬里面 的固体； 阳02引（12) 14000r/min离屯、1分钟，倒出流出液； (13) 14000r/min空离2分钟，W清空Spin Filter中剩余的沈WS-M液体； (14)移动Spin Filter到新的化tch化be中，放置于室溫下风干5分钟； 阳02引 （15)加入50ul的DES，用枪头轻轻揽动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分 钟； (16)取出样品后，14000r/min离屯、1分钟，弃掉Spin Filter,将Catch Tube中的 DM放置于4度冰箱备用， 所述采用细胞震荡破碎仪，W6. 5ΜΛ震荡2分钟对±壤样品进行处理的步骤设置 在步骤（3)和（4)之间。 还包括在对±壤样品进行冷冻处理之后W及提取±壤样品的总DNA之前，对±壤 样品进行研磨。QPCR检测±壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤： (1)采用权利要求1~3任一所述的方法提取待测±壤样品的总DNA ; (2)W待测±壤样品的总DNAW及梯度稀释的阳性对照模板同时进行QPCR反应， 得到±壤样品及阳性对照的扩增曲线和Ct值； (3)根据梯度稀释的阳性对照模板的扩增曲线和Ct值W及待测±壤样品的扩增 曲线和Ct值，判断±壤样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。 所述QPCR反应的体系为：2XSGGreenqPCRMix8μΙ,ΙΟμΜ的正向引物 0. 8μ1，10μΜ的反向引物0. 8μ1，10μΜ的探针引物0. 4μ1，20X探针增强因子1μ1，DNA 模板2μ1，不含核酸酶的(1地2〇 7μ1。 所述正、反向引物及探针引物的核巧酸序列为：正向引物：5 '-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3'；反向引物：5 '-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3'；探针引物：FAM 5, -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3, TAMAR。 所述QPCR反应的程序为：95°C预变性lOmin，1个循环；95°C变性15s，60°C退火 60s，40个循环，扩增结束后取巧光。 从±壤中提取的总DNA包含各种微生物的DNA，因此小麦矮腥黑粉菌的含量很低， 使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，容易产生假阴性结果。而本专利技术提供的DM提取 方法，通过冷冻处理待测±壤样品，改良DNA提取方法，解决了从±壤中难W提取DNA的困 难，实现了±壤中小麦矮腥黑粉菌的定性和定量，能够更早地进行小麦矮腥黑穗病的预警， W便采取有效的防治措施，减少该病害带来的经济损失。 W40] 本专利技术提供的DNA提取方法能够有效地提取出±壤样品的总DNA，并且DNA的质量 较好，其0D260nm/0D280皿的比值均在1.8至1. 9左右，浓度均在200~30化g/μL，有利于 后续的病害检测。 本专利技术提供的方法利用敏度更高的QPCR反应进行检测，通过优化反应体系和反 应程序，能够对±壤中含量极低的小麦矮腥黑粉菌进行定性检测。并且，通过制作标准曲 线，获得标准曲线方程，可^对±壤中的小麦矮腥黑粉菌进行定量分析。【附图说明】 图1.采用本专利技术方法提取的±壤样品的总DNA; 图2.采用FastDNA?SPINKit化rSoil所附带的提取步骤提取±壤样品的总 DNA； W44]图3.QPCR检测±壤样品中小麦矮腥黑粉菌的扩增曲线， 其中，红色是阳性对照按十倍梯度稀释的扩增曲线，黑色是阴性对照，蓝色和绿色 是检测出含冬抱子的不同±壤样品扩增曲线。【具体实施方式】 W下通过实施例对本专利技术进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释 和说明，而不W任何形式限制本专利技术的范围。 下述实施例未特别说明的生物化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，提取DNA前对土壤进行冷冻处理。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高利，蔚慧欣，齐婷，董二容，陈万权，刘太国，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11