本发明专利技术涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱E受体胸腺T细胞(即淋巴细胞)的提取方法。该提取方法包括步骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得。本发明专利技术提供的提取方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱Ε受体胸腺Τ细胞的提取方法。
技术介绍
胸腺肽（Thymosin)，又名胸腺素，是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，其 生理功能包括：连续诱导T细胞分化、发育的各个阶段；维持机体免疫平衡状态，增强T细 胞对抗原的反应；提高机体抵抗疾病的能力。胸腺肽的可以作为一种免疫调节药，主要用于 治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病、某些自身免疫性疾病，还可以对各种细胞免疫功 能低下的疾病及肿瘤进行辅助治疗，其适应症主要包括：各型重症肝炎、慢性活动性肝炎、 慢性迁延性肝炎及肝硬化等；带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣等；支气管炎、支气管哮喘、 肺结核、预防上呼吸道感染等；各种恶性肿瘤前期及化疗，放疗合用并用；红斑狼疮、风湿 性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综合症等；再生障碍性贫血、白血病、血小板减 少症等；病毒性角膜炎、病毒性结膜炎、过敏性鼻炎等；老年性早衰、妇女更年期综合症等； 多发性市肿及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症等；儿童先天 性免疫缺陷症等。由于疗效确切、副作用小，胸腺肽已成为治疗各种免疫性疾病的主要药 物。 在胸腺肽制剂的制备中，检测产品中胸腺肽的活性对于质量控制是至关重要的。 胸腺肽活性常采用T细胞活性测定法一脱E受体法进行测定，它的检测原理是根据胸腺肽 可使脱E受体后的胸腺T细胞（即淋巴细胞）恢复其E受体功能，从而反映胸腺肽的生物 活性，其主要操作过程包括：（1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备；（2)绵羊红血球悬液的制 备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定：求得供试品管E玫瑰花结百分率和对照管E玫瑰花 结百分率，根据如下计算公式求得样品活力： 样品活力=供试品管E玫瑰花结百分率一对照管E玫瑰花结百分率目前，在步骤⑴脱E受体胸腺T细胞悬液的制备主要采用国家药品标准 WS1-XG-042-2000操作方法进行，操作方法为：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量 Hank' s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3~5分钟，弃去上清液， 加入少量Hank' s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟 2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank's液洗 涤，摇匀，以每分钟1500转离心3~5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量 Hank' s，混匀后，置45°C恒温水浴保温30分钟（每隔5分钟振摇一次），取出后以每分钟 1500转离心3~5分钟，弃去上清液。用Hank' s液洗涤稀释并计数。采用此方法提取的 脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度只有约0. 2 X 106个/mL，由于其脱E受体胸腺T细胞悬液 的浓度低，无法满足活力测定的需求。因此，提供一种高浓度的脱E受体胸腺T细胞悬液的 制备方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。该提取方法通过 调整离心的参数后，可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 本专利技术提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法，包括如下步骤： 取动物胸腺与Hank' s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心， 弃去上清液，获得第一沉淀物； 取第一沉淀物与Hank' s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细 胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞； 取胸腺细胞与Hank' s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经 后处理，即得； 第一离心具体为2000~2500转/分钟离心3~5分钟； 第二离心具体为3000~3500转/分钟离心20~30分钟； 第三离心具体为3000~3500转/分钟离心3~5分钟。 本专利技术意外的发现，将国家药品标准WS1-XG-042-2000操作方法中第一离心的参 数调整为2000~2500转/分钟离心3~5分钟，第二离心的参数调整为3000~3500转 /分钟离心20~30分钟，第三离心的参数调整为3000~3500转/分钟离心3~5分钟 后，脱E受体胸腺T细胞的浓度由原来的0. 2 X 106个/mL提高至3. 6 X 106个/mL，可见，本 专利技术提供的脱E受体胸腺T细胞的提取方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。 在本专利技术提供的一些实施例中，第一离心为2000转/分钟离心5分钟。 在本专利技术提供的一些实施例中，第二离心具体为3000转/分钟离心20分钟。 在本专利技术提供的一些实施例中，第三离心具体为3000转/分钟离心5分钟。 在本专利技术提供的一些实施例中，后处理具体为：洗涤，与Hank' s液混合，于40~ 50°C条件下保温20~40min。 优选地，后处理具体为：洗涤，与Hank' s液混合，于45°C条件下30min。 在本专利技术提供的一些实施例中，以g/mL计，胸腺与Hank' s液的质量体积比为2:1。 在本专利技术提供的一些实施例中，过滤的目数为100目。 在本专利技术提供的一些实施例中，淋巴细胞分离液与第二细胞悬液的体积比为1:3。 作为优选，动物胸腺为猪胸腺或小牛胸腺。 在本专利技术提供的一些实施例中，动物胸腺为猪胸腺。 本专利技术还提供了上述提取方法在胸腺肽活力检测中的应用；该提取方法包括步 骤：取动物胸腺与Hank' s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去 上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank' s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细 胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与 Hank' s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得；第一离心 具体为2000~2500转/分钟离心3~5分钟；第二离心具体为3000~3500转/分钟离 心20~30分钟；第三离心具体为3000~3500转/分钟离心3~5分钟；在本专利技术提供 的一些实施例中，第一离心为2000转/分钟离心5分钟；在本专利技术提供的一些实施例中，第 二离心具体为3000转/分钟离心20分钟；在本专利技术提供的一些实施例中，第三离心具体为 3000转/分钟离心5分钟；在本专利技术提供的一些实施例中，后处理具体为：洗涤，与Hank's 液混合，于40~50°C条件下保温20~40min ;优选地，后处理具体为：洗涤，与Hank' s液 混合，于45°C条件下30min ;在本专利技术提供的一些实施例中，以g/mL计，胸腺与Hank' s液 的质量体积比为2:1 ;在本专利技术提供的一些实施例中，过滤的目数为100目；在本专利技术提供 的一些实施例中，淋巴细胞分离液与第二细胞悬液的体积比为1:3 ;作为优选，动物胸腺为 猪胸腺或小牛胸腺；在本专利技术提供的一些实施例中，动物胸腺为猪胸腺。 本专利技术提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。该提取方法包括步骤：取动 物胸腺与Hank' s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液， 获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank' s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液 与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取所述第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与所述第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取所述胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得；所述第一离心具体为2000～2500转/分钟离心3～5分钟；所述第二离心具体为3000～3500转/分钟离心20～30分钟；所述第三离心具体为3000～3500转/分钟离心3～5分钟。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘思川，逯佩荣，刘菊，彭朝晖，李全学，龚丽萍，宁彰艳，方远征，付琴，牛亚飞，
申请(专利权)人：湖南科伦制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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