丝胶蛋白包裹的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法技术

本发明专利技术涉及天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和在肿瘤治疗领域的应用，其制备方法包括：制备纯丝胶蛋白固体；制备介孔硅纳米颗粒；制备具有规则孔道的氨基化、醛基化或双硫化介孔硅纳米颗粒；制备负载药物的氨基化、醛基化或者双硫化介孔硅纳米颗粒；制备pH/蛋白酶或还原/蛋白酶双响应性的丝胶/介孔硅复合型多功能控制体系。本发明专利技术操作简单，原料获得方式简便，成本低廉，普遍适用，无需特殊复杂设备等。使用该方法所制备的纳米复合体系，充分利用了外层丝胶蛋白和内层介孔硅纳米粒子的特性，具有pH/蛋白酶或者还原/蛋白酶双重响应性，具备抑制肿瘤细胞，实时监测纳米粒子定位和药物释放等多重功能，且载药量高，生物相容性好，在肿瘤诊疗领域特别是在解决肿瘤的多重耐药性方面具备广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
丝胶蛋白包裹的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法
本专利技术涉及生物医用复合材料领域，特别涉及多种天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和在肿瘤治疗领域的应用。
技术介绍
随着纳米科学技术的飞速发展，各种各样的有机或无机材料被制成纳米结构用于生物医学领域，尤其是利用纳米材料作为药物载体用于疾病治疗得到了越来越广泛的关注。介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporoussilicananoparticles,MSN）作为一种具有蜂窝状多孔结构的固体材料，具有很多优良的结构特征，如极大的比表面积及孔容积，均一可控的介孔尺寸的孔洞，稳定的理化性质，简易的内外表面修饰以及良好的生物相容性。因此，大量的研究致力于利用介孔硅纳米粒子作为主体用来负载一些客体分子以达到疾病诊疗的目的。为了实现药物在到达靶部位之前的“零释放”，同时使载药系统具有环境刺激响应性，让纳米粒子能够更多的在靶部位富集并且达到药物控释，研究者们在介孔硅表面设计了各种各样的“阀门”，将一些无机纳米粒子，聚合物或者生物大分子通过物理作用或者一些特殊的化学键结合到介孔硅表面，使其具备pH响应、酶响应、热响应、还原响应、光响应等，甚至多重响应特性。更进一步地，为了实现控释系统的多功能化，不少研究者通过负载或者表面修饰一些磁性纳米粒子，量子点或者荧光基团，从而构建出诊疗一体化的多功能智能控释系统。然而大部分的“阀门”设计过程繁琐，且单一的“阀门”设计往往难以达到多重响应的目的。另外，一些“阀门”原料比如金属纳米粒，由于不可生物降解，存在于体内可能产生短期或长期毒性，阻碍了将材料真正应用于人体内的进程。丝胶蛋白（SilkSericin）是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20%-30%，由分子量为24-400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。长期以来由于人们对丝胶蛋白认识的不足和研究的局限性，导致丝胶在缫丝工业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源。近年来人们发现丝胶蛋白具有保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促进细胞粘附和增殖等生物特性，同时，丝胶具有亲水性和可降解性，可以用于生物医用材料领域。目前，已经有研究团队将丝胶蛋白与其他高分子材料如明胶、聚乙烯醇、羟甲基纤维素、聚丙烯酰胺等简单混合，或者直接利用纯丝胶蛋白制备成薄膜、生物支架等应用于组织工程领域，显示出了很好的应用前景。但目前没有任何报道使用丝胶蛋白包裹介孔硅制备药物递送系统。本专利技术采用高温碱提法成功提取蚕茧中的丝胶蛋白，通过静电作用或利用化学键（亚胺键或双硫键等）连接首次将丝胶蛋白包裹于介孔二氧化硅表面，成功地制备了具有良好生物相容性，较高载药量，兼具pH、酶以及还原等多重响应性，且具有荧光特性的多功能智能控释体系，可用于抗肿瘤治疗，特别是针对耐药性肿瘤细胞产生了很好的杀伤效果，并可通过荧光设备进行实时监控，可达到诊疗一体化的目的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供多种天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和应用，该方法制备得到的天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米载体具有良好的生物相容性和较高的载药量，且丝胶本身具有细胞粘附性，能很好地被肿瘤细胞吞噬，且通过细胞内溶酶体的pH/蛋白酶环境或者胞内谷胱甘肽的还原性触发药物释放，以达到杀伤肿瘤的目的。同时，由于丝胶蛋白的荧光特性使得纳米载体本身带有黄绿色荧光，可以实时监控纳米粒的定位及药物的释放，达到诊疗一体化的目的。本专利技术旨在利用丝胶蛋白作为“阀门”包封载药介孔二氧化硅纳米粒子构建出兼具pH/蛋白酶或者还原/蛋白酶等多重响应性的多功能复合型药物控释系统。本专利技术所需实验装置简单，操作过程简便，成本低廉。利用本方法所制备而成的丝胶/介孔硅复合纳米材料具有良好的生物相容性和较高的载药量，且丝胶本身具有细胞粘附性，能很好地被肿瘤细胞吞噬，且通过细胞内溶酶体的pH/蛋白酶环境或者胞内谷胱甘肽的还原性能触发药物释放，以达到杀伤肿瘤的目的。同时，由于丝胶蛋白的荧光特性使得纳米载体本身带有黄绿色荧光，可以实时监控纳米粒的定位及药物的释放，达到诊疗一体化的目的。为达到上述目的，本专利技术提供的丝胶/介孔硅复合型多功能药物控释体系的制备方法，包括以下步骤：一、pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型多功能控制体系（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，再经过透析、冻干即可得到纯丝胶蛋白固体；（2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；（3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒分散于溶剂中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,得到表面氨基化的介孔硅纳米颗粒；（4）将步骤（3）中的氨基化的介孔硅纳米颗粒置于甲醇/盐酸的混合液中回流，洗脱模板后即得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒；（5）将步骤（4）中的氨基化介孔硅纳米粒子与戊二醛混合反应，得到醛基化的介孔硅纳米粒子；（6）将步骤（4）中所得的氨基化介孔硅纳米颗粒或步骤（5）中所得的醛基化介孔硅纳米粒子与药物混合反应，得到负载药物的氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒；（7）通过介孔硅纳米粒中表面的醛基与丝胶蛋白上的氨基反应，或直接利用静电作用将丝胶蛋白包裹在介孔硅纳米颗粒表面，即得到pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型多功能药物控释体系。所述步骤（1）中选用的蚕茧为正常家蚕蚕茧品种（白玉等）、家蚕丝素缺失型突变品种（185Nd-s,140Nd-s,139Nd-s等）或柞蚕蚕茧的一种，购自中国农业科学院蚕业研究所。进一步地，提取丝胶蛋白的具体过程包括：1）称取适量蚕茧，剪成1cm2左右的碎片；2）将剪碎后的蚕茧浸没在0.01-0.05M碳酸钠中，100摄氏度溶解30-60分钟；3）将溶解后的丝胶液转移至3500Da的透析袋中，放入双蒸水中透析48小时；4）将透析袋中的溶液转移至50mL离心管中，离心后收集上清液，置于冷冻冻干机中冻干后可得到粉末状的丝胶蛋白，置于-20摄氏度可长期保存。所述步骤（2）的介孔硅纳米粒子是以十六烷基三甲基溴化铵作为模板，正硅酸四乙酯作为有机硅前体，氢氧化钠作为碱催化剂所制得。具体地，将十六烷基三甲基溴化铵分散于双蒸水中（质量体积比为1g:480mL），再加入氢氧化钠（模板质量的28%），加热搅拌至80摄氏度，缓慢逐滴加入正硅酸四乙酯（模板质量的5倍），持续搅拌2-3小时后，得到白色介孔硅纳米粒子混浊液，离心收集沉淀，甲醇和双蒸水清洗后用真空冷冻干燥机冻干，即可得到白色粉末状带有模板的介孔硅纳米粒子。所述步骤（3）中选用3-氨丙基三乙氧基硅烷实现介孔硅纳米粒子的氨基化，具体过程是指将步骤（2）所得的介孔硅纳米粒子根据质量体积比1g:75mL分散于甲醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌24小时后，离心收集即得到氨基化的介孔硅纳米粒子。本步骤中所用的溶剂甲醇与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为75:2。所述步骤（4）中选用甲醇/浓盐酸混合溶液洗脱所述步骤（3）所得产物中的模板十六烷基三甲基溴化铵，得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米粒子。具体地，是将步骤（3）中所得的氨基化介孔硅纳米粒子分散于甲醇/浓盐酸（体积比为16:1）混合液中，80摄氏度中回流48小时后，即可有效洗脱模板十六烷基三甲基溴化铵，而后离心即可获本文档来自技高网...

【技术保护点】
天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米载体的制备方法，所述天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米载体为天然丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双响应的介孔硅纳米复合型多功能药物控释体系，其制备方法包括以下步骤：（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，再经过透析、冻干即得到纯丝胶蛋白固体；（2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；（3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒分散于甲醇中，加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷，反应得到表面氨基化的介孔硅纳米颗粒；（4）将步骤（3）中的氨基化的介孔硅纳米颗粒置于甲醇和盐酸的混合液中回流洗脱模板，洗脱模板后离心即得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米粒子；（5）将步骤（4）中的氨基化介孔硅纳米粒子与戊二醛水溶液混合反应，得到醛基化的介孔硅纳米粒子；（6）将步骤（4）中所得的氨基化介孔硅纳米颗粒或步骤（5）中所得的醛基化介孔硅纳米粒子与药物混合反应，得到负载药物的氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒；（7）通过负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒介孔硅纳米粒中表面的醛基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的氨基反应，或直接利用静电作用将丝胶蛋白包裹在氨基化介孔硅纳米颗粒表面，即得到丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双重响应的介孔硅纳米硅复合型多功能药物控释体系。...

【技术特征摘要】
1.丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双重响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，溶解后的丝胶液再经过3500Da的透析袋透析、冻干即得到纯丝胶蛋白固体；其中所述的高温碱提法是将剪碎后的蚕茧浸没在0.01-0.05M的碳酸钠溶液中，100摄氏度溶解30-60分钟；（2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；（3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒分散于甲醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应得到表面氨基化的介孔硅纳米颗粒；（4）将步骤（3）中的表面氨基化的介孔硅纳米颗粒置于甲醇和盐酸的混合液中回流洗脱模板，洗脱模板后离心即得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒；（5）将步骤（4）中的具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒分散于浓度为2.5wt%的戊二醛水溶液中，室温避光搅拌24小时，而后离心收集产物，然后用双蒸水清洗多次后，得到醛基化的介孔硅纳米颗粒；其中氨基化介孔硅纳米颗粒与戊二醛水溶液的质量体积比为100mg:10mL；（6）将步骤（4）中所得的氨基化介孔硅纳米颗粒或步骤（5）中所得的醛基化介孔硅纳米颗粒与药物混合反应，得到负载药物的氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒；（7）通过负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中表面的醛基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的氨基反应，或直接利用静电作用将丝胶蛋白包裹在氨基化介孔硅纳米颗粒表面，即得到丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双重响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒；其中所述通过负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中表面的醛基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的氨基反应的具体步骤如下：将步骤（1）得到的纯丝胶蛋白固体加水制备成5-10mg/mL丝胶蛋白水溶液，将丝胶蛋白水溶液加入步骤（6）所得的负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中，避光35摄氏度搅拌6-7小时；而后离心收集产物；然后用双蒸水冲洗产物，置于冷冻真空干燥机中冻干即获得粉末状的纳米颗粒，其中介孔硅纳米粒与纯丝胶蛋白的质量比为1:0.5–1:2。2.丝胶蛋白包裹的具有还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，溶解后的丝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，王征，刘佳，李琪琳，徐鲁明，乞超，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42