一种缢蛏活性八肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种缢蛏活性八肽，其氨基酸序列为：Met-His-Thr–Asp-Asp-Asp-Val–Glu，ESI/MS检测分子量960.10Da；通过以下步骤制得：新鲜缢蛏去壳取肉，缢蛏肉洗净后捣碎，进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值备用；在匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，将所得酶解样品进行超滤、G-25凝胶分离反相高效液相色谱纯化，收集洗脱峰组分并进行氨基酸测序，获得缢蛏活性八肽。该缢蛏活性八肽对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可达90％以上，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础，对进一步研究和开发以缢蛏活性八肽为基础的药物和食品、提高缢蛏活性八肽的经济价值具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物活性肽领域，尤其涉及。
技术介绍
海洋贝类资源丰富且富含许多生理活性物质，因而逐渐被广泛研究和应用。缢 経（Sinonovaculaconstricta)俗名経子，属瓣鲍纲、异齿亚纲、帘蛤目、灯塔蛤科、溢経 属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一，缢蛏肉味鲜美，营养丰富，富含人体生命 活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质， 食品科学，2008, 29 (11) :548-551 ;林叶，苏秀榕，孙蓓等，不同种群缢蛏氨基酸及脂肪酸比 较研究，食品科学，2006, 27 (12) :675-678]。 缢蛏性寒、可补阴去邪热，治烦闷、冷痢、热痢、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高 的药用食用价值;缢蛏的活性成分还具有较高的研究价值，如雷晓凌等 ，对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖 胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强。张永 娟等，提取缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发育及迟发型变态反应的发生，提高小 鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD还能提高血清S0D、GSH-Px水平，降低血清MDA含量。 活性肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理 作用，发挥生理功能，如：调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细 胞代谢，能起到防癌作用等。活性肽一般通过酶解生物活性材料获得，郑惠娜等发现食物蛋 白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽（《海洋蛋白酶解制备生物活性肽的 研究进展》，郑惠娜、章超桦、曹文红，水产科学，2008, 27 (7)，370)。对于缢蛏，在抗肿瘤方面 的研究还很少，特别是利用酶解技术提取多肽在抗肿瘤方面的研究并未见报道。因此对缢 蛏酶解多肽进行研究，对进一步研究和开发以缢蛏酶解多肽多基础的功能性食品和药物， 提高缢蛏的经济价值具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种具有抗肿瘤活性 的缢蛏活性八肽。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述缢蛏活性八 肽的制备方法。 本专利技术所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述缢蛏活性八 肽的应用。 本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该缢蛏活性八肽，其特征 在于该氨基酸序列为：Met_His-Thr-Asp-Asp-Asp-Val-Glu。进一步地，所述八肽的HR-ESI-MS检测的分子离子峰为m/z960.IODa+。 本专利技术解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：包括以下步骤： (1)新鲜缢蛏去壳取肉，缢蛏肉洗净后捣碎，按料液比1:1~3加水进行组织匀浆， 匀浆后调节匀浆液pH值为2~3. 5备用； (2)在上述匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，酶解温度为30~ 45°C，加酶量为300~1200U/g缢蛏肉，酶解时间为2~8h，酶解完成后于30~45°C、2~ 8h进行灭酶； (3)将上述酶解样品过5KD、8KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、分子 量为8~5KD以及分子量小于5KD的酶解液组进行冷冻干燥； (4)将步骤（3)中的各分子量段的酶解液组分别通过MTT法进行抗肿瘤活性检测， 取抗肿瘤活性最高的酶解液组进行G-25凝胶分离，收集相应的洗脱峰； (5)对步骤（4)中收集的洗脱峰进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进 行氨基酸测序，获得所述缢蛏活性八肽。 作为优选：溢蛏活性八肽的制备方法为：⑴新鲜缢蛏去壳取肉，洗净后捣碎，按 料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液PH值为3备用； (2)在上述匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为45°C，加 酶量为300U/g缢蛏肉，酶解时间为8h，酶解完成后于30~45°C、2~8h进行灭酶； (3)将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷 冻干燥； (4)对步骤（3)中收集的酶解液进行G-25凝胶分离，收集洗脱峰5 ; (5)对步骤（4)中收集的洗脱峰5进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进 行氨基酸测序，获得所述缢蛏活性八肽。 前述反相高效液相色谱条件为：ZorbaxSB-C18色谱柱4. 6X250mm5um，检测波 长280nm/214nm，柱温为20°C，进样量为100ul，梯度洗脱，流速为I.Oml/min，流动相A为 0? 06%TFA，B为0? 05%TFA的乙腈，洗脱程序：0%~0%B洗脱4分钟，0%~7%B洗脱 25分钟，7 %~100 %B洗脱1分钟，100 %~100 %B洗脱5分钟。 本专利技术解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种上述缢蛏活性八肽在 制备抗肿瘤药物和食品中的应用。 进一步地，所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的增殖活性，所述肿瘤为人前列腺癌。 再进一步地，所述缢蛏活性八肽对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制率与浓度和 作用时间呈依赖关系。 与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术提供了一种全新的缢蛏活性八肽， 能较好地抑制人前列腺癌细胞增殖活性，对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可高 于90%，体外抗前列腺癌效果显著，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础，该缢蛏活性 八肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，采用胃蛋白酶进行酶解，酶解方式温 和，酶解产品贴合人体自然需要，对进一步研究和开发以缢蛏为基础的药物、提供缢蛏的经 济价值具有重大意义。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中分子量小于5KD的酶解液样品的G-25分离纯化图；图2为本专利技术实施例1峰5样品的反相高效液相色谱图； 图3为本专利技术实施例1中缢蛏活性八肽的质谱（ESI/MS)图； 图4为本专利技术实施例2中缢蛏活性八肽对PC-3细胞增殖活性的影响。【具体实施方式】 以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 实施例1 :缢蛏活性八肽的制备 1、前处理： 取新鲜缢蛏，去壳取缢蛏肉，洗净后沥干备用。 2、胃蛋白酶解 2. 1用高速组织捣碎机将缢蛏肉捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比1:1~3,精密称取 匀浆液，用〇?lmol/L的盐酸溶液和0?lmol/L的NaOH溶液调节匀浆液pH值，加入胃蛋白 酶酶解数小时，酶解条件为：酶解温度30~45°C，pH为2~3. 5,酶解时间2~8h，加酶量 300~1200U/g溢経肉。酶解结束后于100°C下灭酶15min，4°C下离心15min(10000r/min)， 取上清液备用。 2. 2胃蛋白酶解工艺优化 2. 2. 1选用碱性蛋白酶，以A(温度）、B(pH)、C(加酶量）、D(料液比）和E(时间）5 个因素，选4个水平进行L16(45)的正交实验，通过MTT法筛选在不同酶解条件下的酶解液 对前列腺癌细胞增殖抑制率最高的酶解条件，从而确定最佳水解条件，并进行大量酶解。胃 蛋白酶因素和水平如表1所示： 表1胃蛋白酶的因素与水平 2. 2. 2本实施例中选取前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞（原购自中科院上海 细胞库，由本实验室传代保存），细胞培养过程如下： (I)、细胞复苏 从液氮罐中取出存放的PC-3细胞株，快速的放入37 °C恒温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缢蛏活性八肽，其特征在于该氨基酸序列为：Met‑His‑Thr–Asp‑Asp‑Asp‑Val–Glu。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳芳，丁国芳，杨最素，余方苗，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33