一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物生物技术领域的基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，能够调控目的基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。同时本发明专利技术还涉及前述基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于利用植物腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作时，不会对植物的生长发育造成危害。因此，本发明专利技术对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种启动子，尤其涉及一种一种利用分子生物学手段获得的在植物非分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子(proTTPS5)及其在转基因植物中的应用。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandularsecretorytrichome，GST)和非分泌型腺毛(Tshapetrichome,TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，本专利技术致力提供一种克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，同时为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。本专利技术提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述启动子为诱导型启动子。本专利技术还提供一种如上所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，可应用在在植物生产代谢产物的基因工程育种中。进一步地，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。本专利技术还提供一种载体连接有如上述所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。本专利技术还提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗；步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；步骤七、PCR检测转基因植株；步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。进一步地，所述步骤三中调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATAbox、CAATbox、G-box、ARE、ATCT-motif、GARE-motif、HES或G-box。启动子序列中调控元件见下表1：表1：启动子序列中调控元件分析进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入EcoRI酶切位点，引物序列如下表所示：1391z-proTTPS5-F：AACTGCAGTAATCTATGACCCACCACCACTAAAG1391z-proTTPS5-R：CGGAATTCCACTAGACGTGACCGATCGATTAC进一步地，所述步骤六具体包括：1)外植体的预培养；2)农杆菌与外植体的共培养；3)抗性再生植株的筛选。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用有效的青蒿表皮毛组织特异性启动子代替组成型启动子可以用于构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作已获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。附图说明图1是本专利技术的一个实施例的AaTTPS5基因启动子序列及其顺式作用元件；图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；图3为利用AaTTPS5基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proTTPS5通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术进行详尽说明，以下实例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术而不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。实施例本实施例涉及AaTTPS5基因启动子的获得，具体包括如下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子。
3.一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
4.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的用途，其特征在于，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。
5.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。
6.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；
步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，石璞，付雪晴，沈乾，孙小芬，江伟民，吕宗友，颜廷祥，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31