本发明专利技术公开了一株高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用；所述构建方法包括以下步骤：对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统相关基因进行预测；对预测到的三个限制酶基因分别设计基因敲除引物；以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制酶基因，相应获得限制酶基因缺失菌株，所述限制酶基因缺失菌株即为高结合转移率的菌株；相比于基因工程出发菌株WP3ΔSW1，本发明专利技术所得菌株结合转移效率明显提高，获得的单交换克隆子阳性率高，筛选单交换克隆子的工作量明显减少；在高结合转移率的菌株的基础上，通过同源重组至少可以一次性删除41kb的基因组DNA片段，有利于进一步的基因组改造。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用，具体是提 升一株深海来源的希瓦氏菌化ewanellapiezotoleransWP3的结合转移效率的方法，最终 获得一株高结合转移效率的WP3菌株并在此基础上进行基因组大片段的删除。
技术介绍
化ewanella属细菌广泛存在于自然环境，并且是深海中最为丰富的丫-变形菌， 其最重要的特征是它们能W利用多种底物作碳源，具有十分出众的厌氧呼吸的能力，同时 还具备低溫下生长的能力，因此，Shewanella属细菌在生物修复、微生物燃料电池开发等方 面具有潜在的应用价值。目前，化ewanella菌的研究主要集中S. oneidensisMR-1 和S. piezotolerans WP3运两株菌上，S. oneidensisMR-1分离自纽约Lake化eida的沉积物，运株菌在前期已 经建立了稳定的遗传操作系统，通过电转化或结合转移均能有效地实现该菌的遗传操作。 S. piezotoleransWP3分离自自西太平洋深海沉积物（1914m)，前期尝试电转化对该菌进行 遗传操作，但结果并不理想，之后虽然通过结合转移的方法获得了一系列基因敲除突变株， 但是由于筛选单交换克隆子运一步骤的效率很低，导致基因敲除的难度较大，从而限制了 该菌的遗传学及适应性的研究。因此，对WP3进行基因工程改造，提升其结合转移的效率， 具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供一株高接合转移深海细菌希瓦氏菌WP3菌株 及其构建方法和应用，目的在于通过基因工程的方法获得一株高结合转移效率的WP3菌 株，并在该菌株的基础上尝试基因组大片段的删除。 阳0化]本专利技术是通过W下技术方案实现的： 第一方面，本专利技术提供一株高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株，所述菌株通过 包括如下步骤的方法制得：WWP3ASW1为出发菌株，敲除所限制酶基因，相应获得高结合 转移率的菌株。优选地，所述菌株为A swl A swp840、A swl A swp840 A swp2190 (WP3-3 A)或ASW 1 A swp840 A swp2190 A swp9 (WP3-4 A)。更优选地，所述菌株为A swl A swp840 A swp2190 (WP3-3 A)或A swl A swp840 A s wp2190Aswp9(WP3-4A)〇特别优选地，所述菌株为A swl A swp840 A swp2190 A swp9 (WP3-4 A)。 第二方面，本专利技术提供一种所述高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株的构建方 法，所述方法包括W下步骤： 步骤一，对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统（R-Msystem)相关基 因进行预测； 步骤二，对预测到的S个限制酶基因分别设计基因敲除引物； 阳01引步骤三WWP3ASW1为出发菌株，依次敲除所述的立个限制酶基 因，相应获得限制酶基因缺失菌株AswlAswp840(l个限制酶基因缺失的 菌株）、AswlAswp840Aswp2190 (WP3-3A) (2个限制酶基因缺失的菌株）、 AswlAswp840Aswp2190Aswp9 (WP3-4A) (3个限制酶基因缺失的菌株），所述限制酶基 因缺失的菌株即为高结合转移率的菌株。 优选地，步骤二中，所述S个限制酶基因分别为swp9基因、SWP840基因、SWP2190 基因。 优选地，步骤二中，所述基因敲除引物具体为： 所述SWP0009基因的敲除引物：上游引物如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，下 游引物如沈QIDNo. 3和沈QIDNo. 4所示； 所述swp840基因的敲除引物对：上游引物如SEQIDNo. 5和SEQIDNo.6所示， 下游引物如SEQIDNo. 7和SEQIDNo.8所示； 阳0化]所述swp2190基因的敲除引物对：上游引物如沈QIDNo. 9和沈QIDNo. 10所 示，下游引物如SEQIDNo. 11和SEQIDNo. 12所示。 优选地，步骤=中，所述敲除具体包括如下步骤： (l)PCR扩增所述限制酶基因上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段； (2)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌 E.coliWM3064 ; (3)供体菌E.coli丽3064与受体菌WP3ASW1进行细菌结合转移实验； (4)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得1个限制酶基因缺失的菌 株； (5)W所述1个限制酶基因缺失的菌株为受体菌，重复步骤（1)至（4)，依次进行 第2、3个限制酶基因的敲出，即可获得2个限制酶基因缺失的菌株、2个限制酶基因缺失的 菌株。 阳0巧]优选地，步骤（2)中，所述自杀质粒为PRE112。 优选地，步骤（4)中，所述筛选具体指通过含氯霉素的抗性平板筛选。 优选地，步骤（4)中，所述鉴定具体指设计如SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 14所示 的引物进行PCR鉴定。[002引优选地，步骤S中，所述高结合转移率的菌株为AswlAswp840Aswp2190(WP3-3A)(2个限制酶基因缺失的菌株）、 AswlAswp840ASWP2190Aswp9 (WP3-4A) (3 个限制酶基因缺失的菌株）。 更优选地，步骤S中，所述高结合转移率的菌株为AswlAswp840Aswp2190Aswp 9(WP3-4A)。 本专利技术按照上述操作流程分别敲除swp840、swp2190、swp9运3个基因，获得的突 变株分别为AswlAswp840、AswlAswp840Aswp2190 (WP3-3A)、AswlAswp840Aswp219 0Aswp9 (WP3-4A)，且WP3-3A和WP3-4A遗传背景的鉴定结果符合预期（图1和图2)。 第S方面，本专利技术提供一种所述高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株作为基因工 程菌在基因组大片段删除方面的应用，特别是AswlAswp840Aswp2190Aswp9 (WT-4A) 作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。 本专利技术所设质粒、出发菌株已公开于该文献中： Chen,Y.，Wang, F.，Xu,J.，Mehmood, M. A.，and Xiao, X.(2011)Physiological and evolutionary studies of NAP systems in Shewanella piezotolerans WPS. The ISM己 journals:843-855D 与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下： 1、相比于基因工程出发菌株WP3ASW1，WT-4A的结合转移效率明显提高（104)，获 得的单交换克隆子阳性率高，筛选单交换克隆子的工作量明显减少； 2、在WT-4A菌株的基础上，通过同源重组至少可W-次性删除41化的基因组DNA 片段，有利于进一步的基因组改造。【附图说明】 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、 目的和优点将会变得更明显： 图1为限制酶缺失突变株遗传背景的PCR鉴定； 其中M为 1 化generulermarker;1、4、7、10、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株，其特征在于，所述菌株通过包括如下步骤的方法制得：以WP3ΔSW1为出发菌株，敲除所限制酶基因，相应获得高结合转移率的菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王风平，熊磊，蹇华哗，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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