活疫苗制备制造技术

描述的是用于生成含有稳定细菌的活疫苗的方法，以及通过所述方法获得的含有细菌的疫苗，所述稳定细菌携带至少三个减毒突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本专利技术提供了用于生成含有稳定细菌的活疫苗的方法，W及通过所述方法获得的 含有细菌的疫苗，所述稳定细菌携带至少=个减毒突变。 活细菌疫苗中的许多包含已通过生物分子技术操作的减毒细菌。不幸的是，出于 下述原因，该些疫苗中的大多数视为不足W顺应实践需要： (a) 生产是复杂和耗时的，减毒程度不能得到控制，并且相应地对宿主敏感性的适应通 常是不能令人满意的。 (b) 通过立法机构要求的测试方法(临床试验）也是复杂的。 (C)待接种疫苗的群体是有限的。 相比之下，通过代谢漂移（MD)减毒的突变体的特征在于下述优点： (a) 制备成本很低，并且经由增加的世代时间的所需选择的减毒程度和因此各自降低 的菌落大小原则上几乎是任意的。 (b) 当使用具有S个减毒MD突变的稳定特异性疫苗株用于农场动物的疫苗接种时，不 需要精细的测试方法。 (C)将取得甚至更小的批量大小。 关于MD减毒的进化原则的关键数据，应强调下述： (a) 致病因子相对于宿主的相互影响基于相互耐受。当偶然由高度有毒力的致病因子 的减毒突变体感染时，高度敏感的宿主作为单一个体而存活。宿主群体经由少数存活个体 而恢复活力。致病因子作为适应的减毒株而增殖。多发性粘液瘤病是此类过程的典型例子。 结论；细菌群体及真菌和病毒的群体）始终含有逐渐减毒的突变体，尤其是所谓的MD突 变体。 (b) 根据定义MD突变体代表在代谢区室中具有突变的克隆，导致功能障碍（即减毒= 适合度代价)。因此，可W发现与野生株相比较逐步降低的菌落大小(取决于克隆)。正常地， 该些突变体通过免疫活性宿主消除，或可替代地，被适应的正常菌群生长超过。 (C)MD突变体的菌落大小降低与(延长的）世代时间和(增加的）减毒程度反相关。 (d)MD减毒测试疫苗和疫苗令人信服的功效已得到证明。 MD突变体可W作为下述选择且分离： (a) 例如链霉素、利福平、磯霉素、夫西地酸、蒙晚酸的自发MD抗生素抗性（MD"res") 克隆。该些克隆可与剧毒抗性克隆有关超过1%的频率分离。MD"res"和有毒力的抗 性克隆起因于不同突变。相应地，MD"res"和减毒可W视为功能实体。 (b) 在"相继死亡"培养物中的间接累积的环境应激耐受力（iet)增加的突变体。 (C)衍生自链霉素依赖性（Smd)克隆的链霉素不依赖性（Sm-id)抑制基因突变体。该 两种标记突变体由广谱克隆组成，所述广谱克隆的特征在于特别的逐渐降低的菌落大小W 及分别从几乎野生型毒力到过度减毒(微型菌落）的渐增减毒程度的克隆。一般地，核糖体 突变或多或少增加正常错读(错译)，并且唯一的抑制突变也引起减毒。对于例如鸡群体用活的沙口氏菌属（皿we77a)和弯曲杆菌属（<方聲>_77(9知 疫苗的免疫接种，对人类的感染链的中断和因此人肠炎的降低是主要目标。通常，鸡耐受兼 性致病性沙口氏菌属巧日甚至一般的弯曲杆菌属)，而不显示任何临床症状。因此，该些野生 株对于鸡的低毒力要求疫苗株显示中等程度的减毒，一方面确保对于鸡的免疫原性，但另 一方面排除对于人类的危害。 疫苗株功效的一个标准是例如在攻击后能证实的建群程度的降低。甚至对于弯曲 杆菌属，表达细菌的所有组分(例如外膜蛋白质)的MD减毒的活疫苗也可W视为实践导向选 项。 因此，能够开发用于兼性致病菌例如沙口氏菌属和弯曲杆菌属的有效疫苗，条件 是通过调整至低或中等减毒程度来避免过度减毒。换言之，作为减毒等价物的菌落大小降 低不应降至低于野生株菌落大小的约25%。另外，该种必要条件必须与机阳的安全要求一 致；由于存在两个独立的减毒突变的稳定性。回复率/标记为约lOA然而，存在开发疫苗 株的需要，所述疫苗株显示甚至更高的稳定性，即更低的回复率，而不是过度减毒。不幸的 是，引入另外突变W增加活疫苗的安全性通常导致过量减毒，由此致使疫苗较不有效。 因此，本专利技术基础的技术问题是提供特征在于稳定性增加的改良活疫苗株。所述 技术问题的解决方案通过提供权利要求中表征的实施方案来实现，即提供基于至少=个突 变的稳定性增加的改良活疫苗株，然而避免过度减毒且允许将减毒调整至所需水平。事 实上，在导致本专利技术的实验期间，可W显示通过使用MD减毒，可W生成特征在于S个(或 甚至更多个）独立减毒突变的疫苗株，其显示增加的稳定性且减毒程度不超过具有两个MD "res"减毒突变的疫苗株的减毒程度。在本专利技术的实验中使用链霉素，然而，本专利技术中公开 的操作并不仅限于该抗生素。下文描述的实验基于衍生自Smd突变体的所谓的Sm-id克隆 的使用，因为该些"双重标记"突变体(包含显示从野生株样菌落到微型菌落的所有减毒程 度的克隆）允许生成疫苗株，其显示的减毒程度对应于MD"res"单一标记株的减毒程度。 本专利技术的菌株（Sm-id/MD"res")显示约1(T24的稳定性增加。 迄今为止，沙口氏菌属和弯曲杆菌属的Sm-id/MD"res"疫苗株在现有技术中仍未 得到描述。另外，通过逐步渗入两个或S个Sm-id突变和另外的MD"res"(Aa,Aa)标 记而生成的，具有四个、五个或甚至六个减毒突变的疫苗株同样是新型的，对于链霉素：分 别为Smd1 -Sm-idI-Smda-Sm-idII-Sm-a-Sm-idIII(六个减毒突变） 和Sm-id1/Sm-idII/MD"res"(五个减毒突变)。 发现具有两个、四个或六个标记的组合的Sm-id突变体的特定逆转株谱(逐渐降 低的菌落大小）开始；（a)对于Sm-id菌株，具有野生株的菌落大小，（b)对于Sm-id1/ Sm-idII菌株，具有Sm-idI样菌落大小的菌落大小，和（C)对于Sm-id1/Sm-idII/ Sm-idIII构建体，发现的最大菌落仅对应于Sm-id1/Sm-idII样克隆。因此，该些不是 野生株样逆转株。 原则上，Smd突变体作为用于生成Sm-id克隆的起始菌株的选择和分离属于目 前领域发展水平。约10%的例如葡萄球菌属（如7(9cc(9ci)、大肠杆菌（fecAericAia CO")、蜡状芽抱杆菌（&?cj77化cere化0的正常Sm抗性突变体菌落是Smd克隆(作为外观 生物学原则)。然而，该不应用于沙口氏菌属和弯曲杆菌属。在显示抗性的突变体菌落中沙 口氏菌属的Smd克隆的出现频率据报道为约0. 1%，或分别地，此类菌株的分离可仅通过使 用诱变来实现。 有趣的是，在分析约5000种Sm抗性突变体后，本专利技术人无法发现任何Smd菌株。 另外，必须强调Sm-id逆转株的谱取决于Sm克隆而改变，相应地，需要几个Smd克隆作为起 始突变体。换言之，关于选择的常见操作是不适用的。 因为推测核糖体Smd途径是适应的进化原则，所W测试两种可能机制： (a)Smd突变体在其形成后立即进入死亡期。因此，此类突变体只能从对数期培养物中 分离，例如从《18小时/37°C培养物而不是> 48小时/37°C培养物中分离。 (b)在新生状态期间，Smd克隆是脆弱的，显示作为微型菌落(其可能被忽略）的延 迟生长。该些微型菌落适合在传代期间的"正常生长"。 对于弯曲杆菌属，不存在关于Smd-和Sm-id突变体可用的数据。在文献中，仅存 在关于Sm抗性突变体的一些提示本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生成含有稳定细菌的细菌活疫苗的方法，所述稳定细菌携带至少三个和最高达七个减毒突变，其中所述方法包括下述步骤：（a）提供细菌菌株，且使所述菌株在第一抗生素的存在下生长；（b）从（a）的菌株中分离此类“微型”菌落，其对应于依赖于第一抗生素的克隆；（c）使（b）的克隆在不存在第一抗生素的情况下生长，并且分离特征在于菌落大小为野生株菌落大小≥ 50%的减毒逆转株；（d）使步骤（c）中获得的克隆在补充有具有合适浓度的第二抗生素的培养基中生长；（e）分离且连续传代显示大小降低的菌落（MD res）；和（f）分离具有菌落大小的逐步降低作为稳定特性的克隆。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K林德，A格罗斯赫伦泰，
申请(专利权)人：洛曼动物健康有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE