用于扫描电镜的植物幼嫩样品临界点干燥方法技术

本发明专利技术公开了用于扫描电镜的植物幼嫩样品临界点干燥方法。本发明专利技术临界点干燥方法，包括如下步骤：1）用滤纸分别覆盖在临界点干燥器的样品筐的顶部和底部，且在所述滤纸上设有若干便于乙酸异戊酯和CO2的交换的孔；将预处理植物样品放置于所述样品筐中；2）将所述置有所述预处理植物样品的样品筐置于临界点干燥器样品室底部，关闭样品室，2次充气放气，最后充气后静置使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯；3）调节临界点干燥器样品室的温度至35-40℃，放CO2，取出样品，即为干燥后样品。本发明专利技术的实验证明，采用本发明专利技术的方法，可以使样品不变形且达到干燥的目的，尤其针对幼嫩柔软、极易缩水变形的植物组织，效果更明显。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
近年来，随着科学技术的不断发展，扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope, SEM)的发展日臻完善，在各个专业领域的应用越来越广。目前，SEM已成为一种研究微观世界的有力工具，很多重大发现和研究成果都是通过SEM观察获得。虽然近年来出现了环境扫描电镜(Environment ScanningElectron Microscope, ESEM)和冷冻扫描电镜(Cryo-Scanning Electron Microscope, Cryo-SEM),可以观察新鲜的含水样品，但不足之处是分辨率较低，因此目前使用最多的还是观察不含水样品的SEM。就植物样品而言，只有极少数如干种子等含水量极低的样品可以直接喷金用于扫描电镜观察。如果含水量高的样品直接放入样品室，水分蒸发后样品会收缩变形，破坏表面的微细结构，水蒸气引起电子束流大幅度波动，使图像模糊，出现雾状，造成物镜、镜头、光阑等的污染，此外，灯丝碰到水蒸气会氧化变质乃至熔断(郭素枝，扫描电镜技术及其应用，厦门大学出版社，2006:74-84)。所以绝大多数植物样品需干燥处理，干燥是生物样品制备中的关键环节，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度。大多数植物，特别是柔软的细胞和组织，如花器官、嫩芽、幼胚、幼根等，在干燥时由于体积应力和表面张力的作用，容易发生明显的皱缩、塌陷和变形，所以对干燥环节技术要求更高。常用的方法有自然干燥法，冷冻干燥法，烘干干燥法，叔丁醇干燥法和临界点干燥法。临界点干燥被认为是目前生物学扫描电镜样品制备中最可靠、最理想的干燥方法(肖媛，实验室研究与探索，2013，32，45-53)。然而，关于植物样品临界点干燥方法的诸多细节报道较少，特别是幼嫩柔软、极易缩水变形的植物组织。每种物质在一个特定的温度都可以进行相态转化，这个温度就是该物质的临界点。CO2的临界温度为31.1°C，在临界点的压力为临界压力。在临界状态下，液体和气体的密度相等，界面完全消失，液体的表面张力系数为零。临界点干燥虽然是一种非常好的干燥方法，但是操作时有诸多的细节，细小环节的操作不当会导致样品缩水，干燥失败。乙酸异戊酯是一种常用的临界点干燥中间液，因其可以与CO2充分混合，但是样品上残留的乙酸异戊酯如果略多一些，干燥后会残留下来或在排气管中凝结，干燥结束后又会返流进入样品室，浸湿样品。或者导致临界点升高，干燥失败。而样品上残留的乙酸异戊酯过少时，乙酸异戊酯挥发会使样品在空气中干燥，从而导致样品收缩。乙醇也可以作为中间液，但从乙醇中取出来直接用于临界点干燥，样品收缩要大于用乙酸异戊酯做中间液。也可以用丙酮做中间液，但是丙酮易挥发，样品有在样品筐中发生空气干燥的可能性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于扫描电镜的植物样品临界点干燥方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:I)用滤纸分别覆盖在临界点干燥器的样品筐的顶部和底部，且在所述滤纸上设有若干便于乙酸异戊酯和CO2的交换的孔；将预处理植物样品放置于所述样品筐中，得到置有所述预处理植物样品的样品筐；所述预处理植物样品为将植物组织经固定、脱水和乙酸异戊酯置换后得到的含有乙酸异戊酯的预处理植物样品；2)将所述置有所述预处理植物样品的样品筐置于临界点干燥器样品室底部，关闭样品室，充CO2至达到所述样品室容积的60-70%，静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；放气同时充CO2、继续充CO2至达到所述样品室容积的60-70%，再次静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；再次放气同时充CO2、再次继续充CO2至达到所述样品室容积的70%，最后静置使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯；3)调节临界点干燥器样品室的温度至35-40°C，放CO2，取出样品，即为干燥后样品O上述方法中，在步骤I)中，在所述将预处理植物样品放置于所述样品筐中的步骤前还包括如下步骤:将所述样品筐底部覆盖的滤纸用乙酸异戊酯润湿；步骤I)和步骤2)之间还包括如下步骤:在所述临界点干燥器样品室底部放置另一滤纸用于放置所述样品筐，再预冷所述样品室使温度为-10-0°c。上述方法中，步骤2)中，所述静置、所述再次静置和所述最后静置时间均为15-20分钟；所述最后静置的温度为20°C ;步骤3 )中，所述放CO2采用缓慢放CO2，使放CO2的时间为4-5小时。上述方法中，所述滤纸和所述另一滤纸均为定性滤纸，所述滤纸和所述另一滤纸使用时均为单层；步骤I)中，所述预处理植物样品平铺一层放置在所述样品筐的底部； 步骤2 )中，所述放气同时充CO2的时间为3min。上述方法中，所述植物组织为柔软且易缩水变形的植物组织。上述方法中，所述植物组织为花器官、胚或幼根，也可以为其他幼嫩的部位。上述方法中，所述固定为将所述植物样品置于FAA固定液中负压抽气，4°C固定24小时，得到固定后样品；所述脱水为将所述固定后样品依次浸泡在体积百分含量为70%乙醇水溶液、体积百分含量为80%乙醇水溶液、体积百分含量为90%乙醇水溶液、体积百分含量为95%乙醇水溶液、100%乙醇中进行梯度乙醇脱水，各处理20分钟，得到脱水处理后样品；所述置换将上述脱水处理后样品依次浸泡在体积百分含量75%乙醇乙酸异戊酯溶液、50%乙醇乙酸异戊酯溶液、25%乙醇乙酸异戊酯溶液和100%乙酸异戊酯中进行乙酸异戊酯置换，各处理20分钟，得到预处理样品；所述75%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为3:1的乙醇和乙酸异戊酯组成，所述50%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为1:1的乙醇和乙酸异戊酯组成，所述25%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为1:3的乙醇和乙酸异戊酯组成。在步骤3)的取出样品后，还包括将处理后样品进行喷金，得到干燥样品的步骤。本专利技术的实验证明，本专利技术方法中的临界点干燥的步骤中，在临界点干燥器的样品筐上下各附一层滤纸(防止市售CO2不纯，污染样品)，用针扎出小孔(便于乙酸异戊酯和CO2的交换)，用乙酸异戊酯将样品筐下层所附滤纸润湿(防止样品放入后滤纸吸附乙酸异戊酯导致干燥)；该过程要防止乙酸异戊酯挥发，样品自然干燥，也要防止乙酸异戊酯过多导致临界点升高，干燥失败；而在临界点干燥器样品室底部放一张同样大小的圆形滤纸，防止干燥后回流的乙酸异戊酯重新浸湿样品，同时采用长时间置换(各20分钟)和两次放气可以保证乙酸异戊酯和CO2充分交换，且使最后CO2在样品室中的体积准确达到70%，此过程CO2的量是关键，过多或过少都会导致干燥失败，最后干燥完成后长时间放气，可以减少过大的CO2气流对样品的冲击导致样品变形。因此，采用本专利技术的方法，可以使样品不收缩变形且达到干燥的目的，尤其针对幼嫩柔软、极易缩水变形的植物组织，效果更明显。【附图说明】图1为使用本专利技术方法及现有方法干燥的植物幼嫩样品扫描电镜观察【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、1、样品固定将植物幼嫩组织样品采集后立即投入FAA固定液中，注射器负压抽气以去除样品表面的气体。方法是把样品和固定液一起倒入一个大的注射器中，将样品和液体推至上端直至没有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扫描电镜的植物样品临界点干燥方法，包括如下步骤：1）用滤纸分别覆盖在临界点干燥器的样品筐的顶部和底部，且在所述滤纸上设有若干便于乙酸异戊酯和CO2的交换的孔；将预处理植物样品放置于所述样品筐中，得到置有所述预处理植物样品的样品筐；所述预处理植物样品为将植物组织经固定、脱水和乙酸异戊酯置换后得到的含有乙酸异戊酯的预处理植物样品；2）将所述置有所述预处理植物样品的样品筐置于临界点干燥器样品室底部，关闭样品室，充CO2至达到所述样品室容积的60‑70%，静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；放气同时充CO2、继续充CO2至达到所述样品室容积的60‑70%，再次静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；再次放气同时充CO2、再次继续充CO2至达到所述样品室容积的70%，最后静置使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯；3）调节临界点干燥器样品室的温度至35‑40℃，放CO2，取出样品，即为干燥后样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秀苹，冯旻，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11