【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及一种确定原生质体制备和/或使用时所用液体中渗透调节剂浓度的方法及其应用。
技术介绍
1、甜高粱(sorghum bicolor(l.)moench)是目前最受关注的土壤修复植物之一。与其它修复植物相比，甜高粱具有生长周期短、生物量大、抗逆性强、适种范围广等优势。同时，甜高粱还是一种优良的生物质能源植物，其茎秆、籽粒可以通过生物发酵技术生产燃料乙醇，将重金属从食物链转移到能源链中，兼顾了生态和经济效益，因此具有广泛的应用前景。
2、盐角草(salicornia europaea l.)是藜科真盐生植物，能够耐受高达1000mmol/lm nacl，是研究植物耐盐机制的优良材料之一；同时也具有广泛的用途，是优良的蔬菜作物、油料作物、富含蛋白质的饲料作物、污染土壤修复植物和生态景观植物。
3、然而，目前对甜高粱和盐角草遗传转化技术的缺乏，使得对其耐逆机理和品种遗传改良的研究受到极大限制。
4、瞬时表达技术指的是在短时间内将目标基因转入到受体细胞，在受体细胞内建立起高效的表达系统，获得该目标基因短暂而高水平表达的技术。相较于稳定基因表达技术，瞬时表达技术在转化过程中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，并未与受体基因组染色体相整合，为基因、蛋白质研究提供了一种快速、方便的方法。
5、原生质体是植物利用机械或酶解的方式去除细胞壁后得到的裸露细胞，是开展植物学研究的理想材料。
6、植物原生质体是一种良好的瞬时表达媒介，为基因功能、核质互作等方面的研究提供了
7、目前甜高粱和盐角草等植物中仍缺少稳定、高效、普遍适用的原生质体分离及瞬时转化体系。因此，本领域的技术人员致力于探索并建立一种适用于甜高粱、盐角草等植物原生质体的制备及瞬时转化方法，建立适用于甜高粱、盐角草等植物的原生质体分离及转化体系，为这些植物中基因功能的研究提供良好的技术平台。
技术实现思路
1、针对现有缺少稳定、高效、普遍适用的原生质体分离及瞬时转化体系的现状，本专利技术的目的是提供一种普适性广的的植物原生质体的制备方法和转化方法。
2、本专利技术首先提供一种确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法，包括测定作为制备原生质体原料的植物组织汁液的渗透势得到所测渗透势，根据所测渗透势确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度。
3、所用溶液可为下述3种中的任一种或多种：预处理植物材料的缓冲液，原生质体酶解液和/或原生质体转化液。
4、所述测定，可采用露点渗透仪(wescor vapro 5600)。
5、上述确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法中，所述原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度，为如下任一种：
6、a1、以甜高粱品种‘umm el teiman’黄化苗为材料制备原生质体，所述渗透调节剂为甘露醇，所述所用溶液以甘露醇浓度为0.6mol/l的水溶液为原料配制；
7、a2、以甜高粱品种‘m81-e’黄化苗为材料制备原生质体，所述渗透调节剂为甘露醇，所述所用溶液以甘露醇浓度为0.5mol/l的水溶液为原料配制；
8、a3、以甜高粱品种‘cowley’黄化苗为材料制备原生质体，所述渗透调节剂为甘露醇，所述所用溶液以甘露醇浓度为0.5mol/l的水溶液为原料配制；
9、a4、以盐角草肉质茎为材料制备原生质体，所述渗透调节剂为山梨醇，所述所用溶液以山梨醇浓度为0.9～1.1mol/l的水溶液为原料配制。
10、本专利技术还提供一种制备原生质体的方法，以上述确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法确定原生质体制备过程中所用溶液中渗透调节剂浓度，进行原生质体的制备；所述所用溶液为预处理植物材料的缓冲液和原生质体酶解液。
11、上述制备原生质体的方法中，所述预处理植物材料的缓冲液为甘露醇水溶液或山梨醇水溶液；
12、所述原生质体酶解液由缓冲液和酶解所用酶组成，所述缓冲液为在甘露醇水溶液或山梨醇水溶液中溶解mes、cacl2和kcl，并加入牛血清蛋白bsa溶液获得。具体所述缓冲液中mes的浓度为20mmol/l，cacl2的浓度为10mmol/l，kcl的浓度为20mmol/l，加入牛血清蛋白bsa溶液的量为加入溶液体积0.1％的100g/l牛血清蛋白bsa溶液。
13、上述制备原生质体的方法中，针对甜高粱，所述酶解所用酶为12g/l的纤维素酶和4g/l离析酶，所用纤维素酶酶活为>10000u/g，离析酶酶活为>3000u/g；针对盐角草，所述酶解所用酶为20g/l的纤维素酶、10g/l的离析酶和5g/l的果胶酶，所用纤维素酶酶活为>10000u/g，离析酶酶活为>3000u/g，果胶酶酶活为>1000u/g。
14、上述制备原生质体的方法中，原生质体制备时酶解时间为4h。
15、本专利技术还保护以上述原生质体的制备方法制备得到的原生质体。
16、本专利技术还提供一种原生质体转化方法，包括以上述确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法确定原生质体转化过程中所用溶液中渗透调节剂浓度，进行原生质体的转化；所述所用溶液为原生质体转化液。
17、上述原生质体转化方法中，所述原生质体转化液为在甘露醇水溶液或山梨醇水溶液中溶解peg4000和cacl2获得。
18、具体为所述原生质体转化液中peg4000浓度为300g/l，cacl2的浓度为0.1mol/l。
19、上述确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法，或上述制备原生质体的方法，或上述原生质体转化方法的应用也属于本专利技术的保护范围。所述应用为如下p1-p4中任一项应用：
20、p1、在遗传转化中的应用；
21、p2、在植物蛋白质亚细胞定位中的应用；
22、p3、在植物体细胞杂交中的应用；
23、p4、在植物育种中的应用。
24、以往的研究一般通过预实验或者直接参考其他研究采用的酶解液配方来确定酶解液中渗透调节剂(如甘露醇)的浓度，然而，预实验需要花费一定的时间，并且据已有报道的物种和本专利技术中所观察到的现象，不同的物种往往不能采用同样浓度的渗透调节剂。因此，本专利技术创造性地采用露点渗透仪预先对原生质体制备材料进行植物组织汁液的渗透势测定，可简便且快速地确定酶解液及其他缓冲液的渗透压，从而提高了得到高质量原生质体的得率，为后续建立甜高粱瞬时转化体系所需充足的原生质体材料提供了技术保障；进一步通过对转化体系中重要调渗组分peg4000浓度的精准确定，提高了原生质体瞬时体系的基因转化效率。该方法在甜高粱多个品种及盐土植物盐角草中进行了成功的实验验证，可推广至所有物种中，普适性很好。
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1.确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法，其特征在于：所述方法包括测定作为制备原生质体原料的植物组织汁液的渗透势得到所测渗透势，根据所测渗透势确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度，为如下任一种：
3.一种制备原生质体的方法，其特征在于：所述以权利要求1或2所述的方法确定原生质体制备过程中所用溶液中渗透调节剂浓度，进行原生质体的制备；所述所用溶液为预处理植物材料的缓冲液和原生质体酶解液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述预处理植物材料的缓冲液为甘露醇水溶液或山梨醇水溶液；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：针对甜高粱，所述酶解所用酶为12g/L的纤维素酶和4g/L离析酶，所用纤维素酶酶活为>10000U/g，离析酶酶活为>3000U/g；
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：原生质体制备时酶解时间为4h。
7.一种原生质体转化的方
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述原生质体转化液为在甘露醇水溶液或山梨醇水溶液中溶解PEG4000和CaCl2获得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述原生质体转化液中PEG4000浓度为300g/L。
10.权利要求1或2所述的方法或权利要求3-6任一所述的方法或权利要求7-9任一所述的方法的应用，其特征在于：为如下P1-P4中任一项应用：
...【技术特征摘要】
1.确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度的方法，其特征在于：所述方法包括测定作为制备原生质体原料的植物组织汁液的渗透势得到所测渗透势，根据所测渗透势确定原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原生质体制备和/或使用时所用溶液中渗透调节剂浓度，为如下任一种：
3.一种制备原生质体的方法，其特征在于：所述以权利要求1或2所述的方法确定原生质体制备过程中所用溶液中渗透调节剂浓度，进行原生质体的制备；所述所用溶液为预处理植物材料的缓冲液和原生质体酶解液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述预处理植物材料的缓冲液为甘露醇水溶液或山梨醇水溶液；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：针对甜高粱，所述酶解所用酶为12g/l的纤维素酶和4g/...
【专利技术属性】
技术研发人员：李银心，衣泽，林康祺，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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