本发明专利技术涉及螺旋藻类食品中微囊毒素的快速定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：先取螺旋藻固体样品适量，进行预处理，得样品待测液备用；再微囊毒素RR和微囊毒素LR标准品加超纯水制备阳性对照液；再将制备的样品待测液加入HLB柱中进行富集，洗脱，离心，取上清液待测；最后优化色谱条件与质谱条件，对待测上清液进行HPLC-串接质谱法测定。本发明专利技术中，采用冰醋酸或特定体积比的丁醇、甲醇的水溶液作为提取液，提取回收率高，采用质谱多反应监测，对色谱条件及质谱参数均进行了最大的优化，可有效克服干扰，选择性及灵敏度均较高，分析时间短，可满足质量监管部门对螺旋藻类食品中微囊毒素的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测领域，具体涉及。
技术介绍
目前主要的食用藻类主要有螺旋藻及小球藻。螺旋藻类含有丰富的营养成分，包括多种维生素(B1、B2、B6、B12、C、E、K等)、矿物质(钙、铁、锌、磷、镁和碘等)、氨基酸、β-胡萝卜素、γ -亚油酸、叶绿素及蛋白质。世界卫生组织(WHO)定为“人类21世纪的最佳保健品”，1981年美国食品和药品管理局(FDA)确认其为“最佳蛋白质来源之一”，我国卫生部也批准其为“新资源食品”。，目前，国内外对螺旋藻进行过系统的安全性毒理学评价，确认它是安全有效健康的食品。随着人民生活水平及保健意识的提高，人们对保健食品的需求越来越大，同时对保健食品安全性也提出了更高的要求。而螺旋藻在人工养殖和自然环境中，都可能被有毒蓝藻污染，伴生一类可对人类肝脏发生损害的微囊藻毒素。微囊藻毒素是一种单环7肽，至21世纪初已确定的MCYSTs的同分异构体已达60多种，是在蓝藻水华污染中出现频率最高、产毒量最大的一类藻类毒素，其具有强烈的促癌作用，其作用的靶器官是肝脏，它能强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性，导致细胞内多种蛋白质的过磷酸化，导致肝细胞的损伤。由于其生态毒理学效应，日益引起人们的关注。近年来，由于全球环境污染加重，通过产毒微囊藻和其它有害蓝藻污染的水体暴露微囊藻毒素是人类面临的一个公共卫生问题。一些国家和WHO还推荐了饮用水和娱乐用水中微囊藻毒素的安全限量标准，因此，如何有效检测混在螺旋藻中的微囊藻毒素的含量对于我国对藻类保健品的质量监管至关重要。目前，微囊藻毒素的检测方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、ELISA法及HPLC法，PPIA法、ELISA法在检测过程中易受干扰，HPLC法检测过程中样品前处理复杂。为此，本专利技术提供一种检测灵敏度高，定量准确的超高效液相色谱-串接质谱检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种检测灵敏度高、抗干扰性强及检测结果准确的螺旋藻类食品中微囊毒素的检测方法。本专利技术的技术方案如下: ，包括以下步骤: (1)样品前处理:取螺旋藻固体样品l-5g，置于碾钵中研碎后加提取溶剂，放入磁力搅拌器中搅碎，离心，沉淀后用GF/C滤纸过滤，再次加入提取液，重复提取3-5次，将提取液置于旋转蒸发仪上加温浓缩，得样品待测液备用； (2)制备阳性对照液:取微囊毒素RR和微囊毒素LR标准品l_5g，加超纯水溶解配制成1.0ug/ml的阳性对照溶液备用； (3)样品净化:将步骤(I)中制备的样品待测液加入HLB柱中进行富集，洗脱，收集洗脱液置于烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再次富集，再次洗脱，并将洗脱液于旋转蒸发仪上蒸干，取蒸干后的样品加入3-5倍体积的甲醇，转入离心管中，加5-10ml纯化水溶解，离心，取上清液待测； (4)HPLC测定样品中微囊毒素的含量:将步骤(2)中配制好的1.0ug/ml的阳性对照溶液分别进行一级全扫描与二级全扫描机多反应检测，优化色谱条件与质谱条件，对步骤(3)中的待测上清液进行HPLC-串接质谱法测定。优选的，步骤(I)中所述的螺旋藻固体样品剂型包括胶囊、片剂及精粉。优选的，步骤(I)中所述的提取溶剂的加入量为30_50ml。优选的，步骤(I)中所述的提取溶剂选自冰醋酸或醇溶液中的一种或多种。优选的，步骤(I)中所述的冰醋酸为体积浓度为5-10%的冰醋酸。优选的，步骤(I)中所述的醇溶液为丁醇、甲醇和水的混合溶液，所述的丁醇、甲醇、水的体积比为(1-3):(4-12): (20-50)。优选的，步骤(I)与步骤(3)中所述的离心速度为10000-12000r/min，离心时间为20-30min ;步骤(I)中所述的加温温度为50-80°C。优选的，步骤(3)中所述的洗脱过程具体为:先用20-30%的甲醇水溶液洗脱，再用90-100%的甲醇水溶液洗脱。优选的，步骤(3)中再次洗脱过程具体为:先用浓度为10-20%的甲醇水溶液洗脱，再用60-70%的甲醇水溶液洗脱。优选的，步骤(4)中的色谱条件为:流动相为0.3 %甲酸水溶液与乙腈的混合物，其中0.3 %甲酸水溶液与乙腈2-5的体积比为(1-3): (2-5);流速:0.4 mL/min ；色谱柱:Waters Acquity UPLC TM BEH C 18，1.7 μπι, 2.1 mm X 100 mm;柱温:40_45°C ;样品盘温度:4 °C ;洗脱程序:等度，80 %的0.3 %甲酸水溶液，20 %乙腈；进样量:5yL;质谱条件:仪器:Agilent 6460型三重四极杆质谱仪；电离源模式:电喷雾离子化；电离源极性:正离子模式；雾化气:氮气；雾化气压力:50 -55psi ；毛细管电压:3400-3600V ;干燥气温度:325 -3400C ;干燥气流速:5 L/min ;鞘气温度:380-400 °C ;鞘气流速:12 L/min ;监测方式:多反应监测。本专利技术与现有技术相比，有益效果体现在: 1.在微囊毒素的检测过程中，常规的提取液虽然提取目标成分效果也好，但由于其组分太复杂，易产生基质效应，影响后期目标成分的定量分析。本专利技术中，采用体积浓度为5-10%的冰醋酸或体积比为(1-3): (4-12): (20-50)的丁醇、甲醇的水溶液作为提取液，在提取两种微囊毒素时可以得到较高的回收率，可有效提高目标组分的提取。2.目前，微囊藻毒素含量的测定方法包括许多，且水样中微囊藻毒素的测定方法较为成熟，而生物样品及螺旋藻类固体样品中微囊毒素的测定方法研宄却并不多，且国外学者等采用免疫亲和柱纯化HPLC检测，样品加标回收率约为80%。本研宄，在传统测定方法基础上采用质谱多反应监测，可有效克服检测样品中干扰组分对检测结果的影响，且通过测定特定质荷比的碎片离子峰，选择性及灵敏度均较高。3.由于螺旋藻类食品中干扰组分较多，为了改善峰形，提高样品分离度，缩短分析时间，本专利技术中在对样品进行预处理时，采用两次梯度洗脱，在HPLC-串联质谱检测过程中，也选择梯度洗脱，可使流出组分分离度更高，而且可明显提高色谱峰的峰对称性，使目标成分分离效果更好，避免了内源性杂质对目标成分分离的影响。4.本研宄在在采用质谱多反应监测过程中，选择特定浓度的特定体积比的甲酸水溶液与乙腈作为流动相，可明显提高微囊毒素RR和微囊毒素LR样品的离子化效率及检测响应灵敏度。5.为了获得微囊毒素检测的最佳质谱参数，本专利技术还设置了阳性对照组，对色谱条件及质谱参数均进行了最大的优化，从而最大限度提高了检测的灵敏性及检测结果的准确性。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明: 所述的阳性对照品微囊毒素RR和微囊毒素LR标准品购于TaiWan Algal ScienceInc0实施例1 ，包括以下步骤: (1)样品前处理:取螺旋藻胶囊样品lg，置于碾钵中研碎后加30ml5%的冰醋酸，放入磁力搅拌器中搅碎，以10000r/min离心20min，沉淀后用GF/C滤纸过滤，再次加入提取液，重复提取3次，将提取液置于旋转蒸发仪上加温至50°C浓缩，得样品待测液备用； (2)制备阳性对照液:取微囊毒素RR和微囊毒素LR标准品lg，加超纯水溶解配制成1.0ug/ml的阳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种螺旋藻类食品中微囊毒素的快速定量检测方法,其特征在于，包括以下步骤：（1）样品前处理：取螺旋藻固体样品1‑5g，置于碾钵中研碎后加提取溶剂，放入磁力搅拌器中搅碎，离心，沉淀后用GF/C滤纸过滤，再次加入提取液，重复提取3‑5次，将提取液置于旋转蒸发仪上加温浓缩，得样品待测液备用；（2）制备阳性对照液：取微囊毒素RR 和微囊毒素LR 标准品1‑5g，加超纯水溶解配制成1.0ug/ml的阳性对照溶液备用；（3）样品净化：将步骤（1）中制备的样品待测液加入HLB柱中进行富集，洗脱，收集洗脱液置于烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再次富集，再次洗脱，并将洗脱液于旋转蒸发仪上蒸干，取蒸干后的样品加入3‑5倍体积的甲醇，转入离心管中，加5‑10ml纯化水溶解，离心，取上清液待测；（4）HPLC‑串接质谱法测定样品中微囊毒素的含量：将步骤（2）中配制好的1.0ug/ml的阳性对照溶液分别进行一级全扫描与二级全扫描机多反应检测，优化色谱条件与质谱条件，对步骤（3）中的待测上清液进行HPLC‑串接质谱法测定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭狄，
申请(专利权)人：中山鼎晟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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