定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法，该方法对正常人的血浆游离DNA和机械打断的组织DNA测序后，统计在血浆游离DNA测序序列和组织DNA测序序列中含量存在显著差异的差异序列集合，并通过计算得出来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值、来自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值，最后结合待检样本的差异序列对应片段百分比总量的实际值，计算得到待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度。此外，本发明专利技术计算得到的待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度值，还可用于对游离DNA样本的质控以及对组织坏死的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种用于定量样本中源自细胞凋亡的 DNA浓度的方法及其应用。
技术介绍
血浆中存在游离DNA (或称循环DNA，也简称cfDNA)，游离DNA来自凋亡细胞，是一 种无细胞状态的、片段化的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。CfDNA在正常 人的血液中含量甚微，平均值为13ng/ml，而当机体在一些特殊状态时（如患有肿瘤、自身 免疫性疾病、感染性疾病、中风、心肌梗死及妊娠等），其含量明显上升，比如恶性肿瘤患者 平均值达到180ng/ml。因此，游离DNA在疾病的早期诊断、预后和监测等方面具有重要潜在 价值。 -直以来，由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关游离DNA与疾病 相关性的研宄在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，使这一领域 的研宄在最近二十多年得到了较迅速发展。但是，游离DNA含量少，而且高度片段化，提取 cfDNA往往成为后续实验成败的关键。 组织内DNA片段（gDNA)为机械或其他理化形式打断，其与游离DNA在序列组成上 会有差别，cfDNA在提取过程中可能混入gDNA序列片段，大量混入对后续分析造成影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法，该方法 通过DNA片段的碱基组成信息来对样本中源自细胞凋亡的DNA浓度进行定量。 本专利技术的另一目的在于提供上述定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法的 应用。 为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式所提供的定量样本中源自细胞凋亡的 DNA浓度的方法，包含下述步骤： (1)取健康人的血浆游离DNA样本和机械打断的组织DNA样本，分别测序，将测序 获得的序列比对到人类参考基因组上，统计差异序列集合，所述差异序列集合中包含若干 差异序列； 所述差异序列为：比对到人类参考基因组上的测序序列5'端k个碱基的序列，且 游离DNA样本的测序片段中5'端为该种差异序列的序列含量比例，与组织DNA样本的测序 序列中5'端为同种差异序列的序列含量比例存在显著差异；其中，k为自然数； (2)计算游离DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列中，所有5'端为差 异序列的序列百分比总和，作为来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估 计值； 计算组织DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列中，所有5'端为差异序 列的序列百分比总和，作为来自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计 值； (3)对待检样本进行测序，将测序获得的序列比对到人类参考基因组上，计算所有 5'端为差异序列的序列百分比总和，作为待检样本的差异序列对应片段百分比总量的实际 值； (4)根据上述来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值、来 自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值以及待检样本的差异序列 对应片段百分比总量的实际值，计算得到待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度。 Cf DNA是来自于骨髓中性粒细胞凋亡的DNA片段，该种DNA片段由细胞内限制性内 切酶切割全基因组DNA而来，限制性内切酶对DNA的切割是有一定偏向性的，本专利技术根据该 原理设计了上述定量样本源自细胞凋亡的DNA浓度的方法，在假定血浆游离DNA皆源自细 胞凋亡的基础上，以比对到人类参考基因组上的测序序列5'端、可显著区分游离DNA和机 械打断的组织DNA的差异序列的含量特征，实现对样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的定量。 具体地，本专利技术的实施方式所提供的定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法 中，步骤（4)中的根据来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值、来 自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值以及待检样本的差异序列 对应片段百分比总量的实际值，计算得到待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度的计算式 为： p X p/' + (I - p) X p/ = P! 其中： P为要计算的待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度； Psef为来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值； P/ Λ来自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值； /?为待检样本的差异序列对应片段百分比总量的实际值。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法 中，获取步骤（1)中的血浆游离DNA样本和机械打断的组织DNA样本的方法为：抽取健康人 的血液，进行第一次离心，得到上清液和沉淀，取沉淀，再进行机械打断，即为机械打断的白 细胞样本，作为机械打断的组织DNA样本；对第一次离心得到的上清液进行第二次离心，去 掉沉淀，取上清液，即为血浆游离DNA样本。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法 中，步骤（1)中的统计差异序列集合的方法为： 记比对到人类参考基因组上的测序序列5'端k个碱基的序列为Kmer，k为自然 数；记差异序列集合为S ;记游离DNA样本组为6。{组，记组织DNA样本组为G g组： (1)根据Kmer的不同分别对Gef组和G 8组的测序序列进行分组，统计每组序列的 比例： 其中： P^meri表示样本j的测序序列中，5'端以Kmer开始的序列在所有测序序列中的比 例、 农示样本j的测序序列中，5'端以Kmer开始的序列的条数、 Σ 表示样本j的所有测序序列的条数； (2)统计在GjP G i且中具有显著差异的kmer : 其中： 依次表示在Grf组和G g组中5'端为特定Kmer的序列在每个样本 的测序序列中的含量比例的平均值、 ?依次表示在Gcf组和Gg组中5'端为特定Kmer的序列在 每个样本的测序序列中的含量比例的总和、 Σ cfj、Σ gj依次表示Gcf组和G g组中样本的个数； 比较上述和Zfmer?，选取: iV的所有Kmer作为集合S，其 中，N > 1〇 优选地，上述K和N的取值优选为：K为1~10，1 < NS 10。更进一步地，对 S集中Kmer的约束为第一个碱基为G或者C ;N的取值方法如下：对于特定的K的取值， ViV e α+χ)，根据步骤⑷可计算出一系列的差异集合S，对于特定的S，计算Grf组的 每个样本的Ps，Ps表示样本序列5'端的Kmer属于S集的序列占总序列的百分比，计算所有 Gcf组中P s集的标准差sd ;计算G 8组样本的P s;在保证步骤（4)中G rf组中P s集和G g组中 Ps集显著差异的约束下，取使得sd极小的N值。 进一步地，本专利技术的实施方式所提供的定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方 法中，步骤（2)中计算游离DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列中，所有5'端 为差异序列的序列百分比总和，作为来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量 的估计值的公式为：其中： PsV为要计算的来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值； Σ/fmer e S尸表示血浆游离DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列 中，所有5'端为差异序列的序列百分比总和。 进一步地，本专利技术的实施方式所提供的用于定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度 的方法中，步骤（2)中计算组织D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量样本中源自细胞凋亡的DNA浓度的方法，其特征在于，包含下述步骤：(1)取健康人的血浆游离DNA样本和机械打断的组织DNA样本，分别测序，将测序获得的序列比对到人类参考基因组上，统计差异序列集合，所述差异序列集合中包含若干差异序列；所述差异序列为：比对到人类参考基因组上的测序序列5’端k个碱基的序列；且游离DNA样本的测序序列中5’端为该种差异序列的序列含量比例，与组织DNA样本的测序序列中5’端为同种差异序列的序列含量比例存在显著差异；其中，k为自然数；(2)计算游离DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列中，所有5’端为差异序列的序列百分比总和，作为来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值；计算组织DNA样本组比对到人类参考基因组上的测序序列中，所有5’端为差异序列的序列百分比总和，作为来自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值；(3)对待检样本进行测序，将测序获得的序列比对到人类参考基因组上，计算所有5’端为差异序列的序列百分比总和，作为待检样本的差异序列对应片段百分比总量的实际值；(4)根据上述来自于细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值、来自于非细胞凋亡样本的差异序列对应片段百分比总量的估计值以及待检样本的差异序列对应片段百分比总量的实际值，计算得到待检样本中源自细胞凋亡的DNA的浓度。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾丰波，杨功达，韩继臣，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31