本发明专利技术公开了一种RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒，所述试剂盒中包含有由用于通过RPA技术检测口蹄疫病毒的通用型、分型引物和探针组成的引物探针液及其中通用引物和探针，本发明专利技术系首次采用RPA-侧流层析技术建立快速检测牛FMDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。采用本发明专利技术的引物和探针组合，通过RPA技术对FMDV气溶胶进行分型检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的通用型和分型引物、探针及其试剂盒。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的发生在猪、牛、羊等偶蹄类动物上的急性、 热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为"A类烈性传染病"，一旦暴发，必须扑杀 感染及接触感染的动物，造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及 相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65 个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家， 主要流行〇型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了 Asia 1型口蹄疫，2009 年和2013年爆发了 A型口蹄疫，近年来，均有0型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养 殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也越来越大。 由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度 微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成 环境生物污染和传染病传播。口蹄疫病毒能在空气中形成气溶胶，病毒可随风散播到50~ 100公里外的地方，传播速度快，距离远，难于防御。因此，通过建立一种适用于口蹄疫病毒 气溶胶的检测方法，将为口蹄疫预报预警提供配套技术。 目前应用于气溶胶病毒的检测方法主要有培养法和分子生物学方法，口蹄疫病毒 的分离培养要求在生物安全三级以上实验室进行，并需要特殊的仪器设备和专业的技术人 员，在分离过程中存在病毒扩散的危险，且耗时长。而PCR及其相关的技术可以检测口蹄疫 病毒的核酸，但需要复杂的仪器设备，难以满足非实验室等现场环境下的检测要求。 重组酶聚合酶扩增（recombinase ploymerase amplification, RPA)技术是不同 于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物 结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模 板DNA解链，引物与模板DNA配对，并在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模 板分子得到大约1〇 12扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37°C~42°C等 温条件下，反应20余分钟即可得到扩增产物（Forget et al.，2012)。RPA可以与侧向流动 免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的 探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、 切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记 的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检 测线。该方法检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。 但目前对于RPA技术的研宄尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于 FMDV气溶胶检测的报道。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46~52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长 度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重 要。RPA技术正处于起步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其 引物设计原则提供依据。
技术实现思路
针对RPA-侧流层析技术应用于FMDV气溶胶检测领域的空白，本专利技术提供了一种 RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒，该试剂盒使用准确、快速、简 便。 为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案： -种RPA-侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的通用引物和探针，其正向引物序列 如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列如SEQ ID No. 3所示。 正向引物 FMDV-F :5' -GAGTACATTGAGAAACCAAACATCACCACA-3'，（SEQ ID No. 1); 反向引物 FMDV-R :5' -【Biotin】 GGCGTAGGGTCCTTCAGCTTGTGGTTGT-3'，（SEQ ID No. 2)； 探针序列 FMDV-P :5'-【FAM】TCTGGAGACTAGTGGTGCCAGCACTGTTA【dSpacer】 TTTCAGAGAGATAACTCTCC【C3-spacer】-3' ；（SEQ ID Νο·3)。 一种RPA-侧流层析检测A型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 4所示，反向引物序列如SEQ ID No. 5所示，探针序列如SEQ ID No. 6所示。 正向引物 A-F : 5 ' -CACCTGAGGCAGCACTGGACAACACGAGCAA-3 ' ；（SEQ ID No. 4) 反向引物 A-R :5' -【Biotin】GCACGAGGAGTTCTTGGATCTCCGTGGCTC-3' ；（SEQ ID No. 5) 探针序列 A-P :5'-【FAM】CACTGGACAACACGAGCAACCCCACTGCTTA【dSpacer】 TATAAAGCACCGTTCACA【C3-spacer】-3' ；（SEQ ID Νο·6)。 一种RPA-侧流层析检测Asia I型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如 SEQ ID No. 7所示，反向引物序列如SEQ ID No. 8所示，探针序列如SEQ ID No. 9所示。 正向引物 Asial-F :5' -CGAATCAGCAGACCCAGTTACCACCACAGT-3' ；（SEQ ID No. 7) 反向引物 Asial-R :5' -【Biotin】 GAGAAGTAGTACGTCGCAGACCGAAGTAGCG-3' ；（SEQ ID No.8) 探针序列 Asial-P :5' -【FAM】ACCCGCCTGGCACTCCCTTACACCGCTCCCC【dSpacer】 ACCGTATGCTTGCAACAGT【C3-spacer】-3' ；（SEQ ID Νο·9)。 一种RPA-侧流层析检测0型FMDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 10所示，反向引物序列如SEQ ID No. 11所示，探针序列如SEQ ID No. 12所示。 正向引物 Asial-F :5' -CAACACCACCAACCCAACGGCGTACCATAA-3' ；（SEQ ID No. 10) 反向引物 Asial-R :5'_【Biotin】TTGATGGCACCGTAGTTGAAAGAAGTAGGC-3' ；（SEQ ID No. 11) 探针序列 Asial-P :5' -【FAM】CGTACCATAAGGCGCCGCTTACCCGGCTTA【dSpacer本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RPA‑侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的通用型引物和探针，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王洪梅，何洪彬，刘文浩，贺文琦，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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