一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒。主要用于孕妇、新生儿和免疫功能低下人群，包括移植患者、艾滋病患者、肿瘤患者、糖尿病患者和年龄因素导致免疫功能下降的老年人的人巨细胞病毒活动性感染的快速监测及诊断。本发明专利技术同时也涉及使用该检测方法的试剂盒制备。

【技术实现步骤摘要】
一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒
本专利技术属抗体工程和诊断方法领域，尤其涉及一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，中国约90％成人可检出HCMV抗体。HCMV一旦感染将终身潜伏于宿主机体中，在免疫功能正常的人群病毒与宿主处于“平衡”状态，当机体由于各种原因导致免疫力低下时(HIV感染、移植和衰老等)，这种“平衡”就会被打破引起HCMV再激活感染，引起再激活感染的病毒可以来自宿主本身也可以来源于其他感染者。原发感染和再激活感染统称活动性感染,AIDS患者、移植受者和老年人中，HCMV活动性感染可引起多种疾病，甚至导致死亡；在免疫功能尚未发育成熟的胎儿则为致畸性，导致出生缺陷。在我国目前HCMV的先天性感染率还不确定，但研究表明，发达国家先天性HCMV感染率比发展中国家要低，其中意大利为0.47％(CI:0.22–1.0％)；瑞典为0.46％(CI:0.37–0.58％)；冈比亚HCMV的先天性感染率高达13.6％；美国为1％，每年约40000新生儿伴有先天性HCMV感染，其中10％～15％发生迟发性后遗症，主要为SNHL、智力障碍、学习能力低下等神经系统损伤性疾病，其中因SNHL每年付出高达10亿美元的医疗帐单。2011年我国出生人口约1615万，根据美国的数据推算，2011年我国约有16.2万新生儿发生了先天性HCMV感染，家庭和国家都将为此支出高昂的成本，有学者报道，实际我国先天性HCMV感染新生儿是16.2万人/年的2-3倍。在HIV患者中，HCMV是引起患者视网膜病变进而失明的最主要病原体，截止到2013年底我国共报告HIV感染者和艾滋病病人共43.4万例，而且感染情况呈上升趋势。目前的抗逆转录病毒治疗可以大大延长HIV感染者的存活时间，甚至接近自然死亡年龄，但是HCMV病毒感染引起的失明在HIV患者中急需解决。我国实施器官移植的例数也呈逐年增多的趋势，2013年仅肾移植一项，我国就实施6400余例。HCMV间质性肺炎、GVHD是异基因骨髓移植最常见或最严重的并发症，如发生HCMV肺炎，病死率可高达80％～90％。在免疫衰老的老年人中HCMV感染会是多种慢性病的危险因子尤其是心血管疾病、糖尿病和肿瘤，直接影响寿命。一项研究通过检测HCMVpp65T细胞反应调查65岁以上人群中HCMV细胞免疫水平，并对他们跟踪调查生存率，发现pp65T细胞反应阳性(对HCMV有细胞免疫作用)的人群同一时间段的死亡率远低于pp65T细胞反应阴性的人群(对HCMV无细胞免疫作用)，而且该人群中由心血管系统疾病死亡的比率出现了大于2倍的增加。临床也已观察到在免疫低下人群中HCMV感染会减少胰岛素的释放，而且胰岛β细胞是HCMV的靶细胞，因此对HCMV的免疫防御低下也是二型糖尿病的危险因素。此外，免疫衰老人群HCMV感染还与肿瘤、风湿性关节炎和克罗恩病等慢性炎症性疾病相关。目前还没有可预防HCMV感染的疫苗，但临床研究已发现早期抗病毒治疗可以减轻先天性感染儿童神经系统损伤，挽救听力；可以降低移植患者病死率、避免过度免疫抑制；预防艾滋病人视网膜病变。因此，临床急需快速、准确的HCMV活动性感染检测手段，常规病毒分离培养虽是HCMV诊断的“金标准”，但需4周才能获阳性结果，难以满足快速诊断的要求。ELISA法检测HCMV特异性IgM抗体可用于免疫功能正常的HCMV活动性感染或HCMV病的诊断，但其阳性率低，在严重免疫抑制患者可缺乏抗体反应或抗体延迟出现。HCMVpp65为被膜蛋白，位于该病毒的衣壳和其包膜之间，属于低基质磷酸化蛋白，分子量为65kD，占病毒总蛋白的15％，是激发机体细胞免疫的主要病毒蛋白。由于HCMV主要潜伏于人外周血单个核细胞，发生再激活感染时病毒首先在单个核细胞中复制增殖，再随血流播散引起体液免疫反应。因此，单个核细胞中pp65抗原出现的时间较特异性IgM抗体出现早，且不会因为患者免疫功能低下而表达降低。同时检测出pp65抗原血症不仅可以说明存在HCMV再激活感染，也可以说吗患者缺失针对HCMV的细胞免疫力。因此，通过检测患者HCMVpp65抗原血症是新近被临床广泛接受的检测HCMV活动性感染的“新金标准”。鉴于此，我们建立了利用监测患者外周血pp65抗原血症来诊断HCMV活动性感染的方法，并形成检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒。为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用红细胞裂解液处理新鲜外周血标本裂解红细胞，再收集、洗涤离心沉淀获得相应白细胞，制备检测用的细胞涂片；(2)采用自制HCMVpp65单克隆抗体对细胞涂片进行间接免疫荧光检测；所述的自制HCMVpp65单克隆抗体为从HCMVpp65真核表达载体免疫小鼠制备的杂交瘤细胞培养上清中纯化获得；(3)在荧光显微镜下观察检测结果；(4)观察结果需要在阳性对照和阴性对照同时成立的情况下才可信，样品中出现≥1个阳性荧光信号即可判定为人巨细胞病毒活动性感染阳性，出现≥50个阳性荧光信号即可判定为人巨细胞病毒活动性感染强阳性；所述的人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法，其特征在于，所述的自制HCMVpp65单克隆抗体制备方法为：A、HCMVpp65DNA重组质粒的获取(1)根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMVpp65基因编码序列，设计用于扩增HCMVpp65的PCR引物，以HCMVAD169株RNA为模板，逆转录成cDNA,再通过PCR扩增出不含内含子的UL83基因，将其克隆至pcDNA3.0载体上，构建重组质粒pcDNA3.0-pp65，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒；(2)将序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒转染至HEK293细胞，24h后Westernblotting鉴定其是否能够在真核细胞中表达HCMVpp65蛋白，鉴别出能够在真核细胞中表达HCMVpp65蛋白的序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒；(3)将含有鉴别出的pcDNA3.0-pp65质粒的菌种大量培养，收集菌体后通过碱裂解法裂解菌体，再依次经Sepharose4FF分子筛、PlasmidSelect亲和层析和SOURCE30Q阴离子柱层析纯化，得到纯化后的pp65DNA重组质粒；B、小鼠免疫将纯化后的pp65DNA重组质粒与佐剂按3:1的比例混合，对小鼠进行多点肌肉注射；每隔2周免疫一次，共4次；最后一次免疫后1周，鼠尾采血通过琼脂双扩散试验检测抗体滴度，取抗体滴度大于1:8的小鼠，处死后无菌取出脾脏，研磨法获得免疫后的BALB/c小鼠脾的细胞；C、细胞融合取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫后的BALB/c小鼠脾细胞按1:10的比例混合均匀，1000rpm离心10min，弃上清，置37℃水浴预热，用1ml吸管在45s内加完预热至37℃的1ml浓度50％的PEG1500，边加边轻轻振荡，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用红细胞裂解液处理新鲜外周血标本裂解红细胞，再收集、洗涤离心沉淀获得相应白细胞，制备检测用的细胞涂片；（2）采用自制HCMV pp65单克隆抗体对细胞涂片进行间接免疫荧光检测；所述的自制HCMV pp65单克隆抗体为从HCMV pp65真核表达载体免疫小鼠制备的杂交瘤细胞培养上清中纯化获得;（3）在荧光显微镜下观察检测结果；（4）观察结果需要在阳性对照和阴性对照同时成立的情况下才可信，样品中出现≥1个阳性荧光信号即可判定为人巨细胞病毒活动性感染阳性，出现≥50个阳性荧光信号即可判定为人巨细胞病毒活动性感染强阳性。

【技术特征摘要】
1.一种自制HCMVpp65单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、HCMVpp65DNA重组质粒的获取（1）根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMVpp65基因编码序列，设计用于扩增HCMVpp65的PCR引物，以HCMVAD169株RNA为模板，逆转录成cDNA,再通过PCR扩增出不含内含子的HCMVpp65基因，将其克隆至pcDNA3.0载体上，构建重组质粒pcDNA3.0-pp65，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒；（2）将序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒转染至HEK293细胞，24h后Westernblotting鉴定其是否能够在真核细胞中表达HCMVpp65蛋白，鉴别出能够在真核细胞中表达HCMVpp65蛋白的序列正确的pcDNA3.0-pp65质粒；（3）将含有鉴别出的pcDNA3.0-pp65质粒的菌种大量培养，收集菌体后通过碱裂解法裂解菌体，再依次经Sepharose4FF分子筛、PlasmidSelect亲和层析和SOURCE30Q阴离子柱层析纯化，得到纯化后的pp65DNA重组质粒；B、小鼠免疫将纯化后的pp65DNA重组质粒与佐剂按3:1的比例混合，对小鼠进行多点肌肉注射；每隔2周免疫一次，共4次；最后一次免疫后1周，鼠尾采血通过琼脂双扩散试验检测抗体滴度，取抗体滴度大于1:8的小鼠，处死后无菌取出脾脏，研磨法获得免疫后的BALB/c小鼠脾的细胞；C、细胞融合取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫后的BALB/c小鼠脾细胞按1:10的比例混合均匀，1000rpm离心10min，弃上清，置37℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至37℃的1mL浓度50%的PEG1500，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20%FCS和HAT的1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5%CO2培养箱中培养，观察细胞的生长状况，4~6天后用含有20%FCS和HT的1640培养基继续培养，再次换液时仍用有20%FCS和HT的1640培养基继续培养，4~6后改用20%FCS的1640培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，甘霖，刘峰，
申请(专利权)人：王明丽，安徽博睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34