一种高灵敏度抗CD20单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高特异性抗CD20单克隆抗体及其应用，具体地，提供了一种多肽，其特征在于，具有如式I的结构：X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1-COOH，式I；其中，X0为无，或乙酰基（CH3-CO-）等保护基，X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。本发明专利技术多肽可特异性结合于抗CD20单克隆抗体，从而通过ELISA准确地测定样品内极微量的利妥昔单抗(Rituximab)等抗CD20单克隆抗体，方法简单、经济，特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度抗CD20单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物样本检测领域，具体地，涉及利妥昔单抗(Rituximab)等抗CD20单克隆抗体的检测。
技术介绍
目前已有多种方法用于检测利妥昔等重组人-鼠嵌合抗CD20单克隆抗体。如利用利妥昔单抗的单克隆抗体或多克隆抗体用ELISA法检测。有报道利用未标记的羊抗利妥昔单抗多克隆抗体作为包被物，HRP-羊抗人Fc片段作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。也有人设计了一种鼠抗利妥昔单抗MB2A4，用该抗体作为包被物，HRP-羊抗人Fc片段作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。还可以利用猴血清吸附过的未标记的羊抗人作为包被物，猴血清吸附过的HRP-羊抗人作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。这些方法都是常规的基于抗原-抗体的ELISA法。上述的这些方法仍存在一些缺点。比如多克隆抗体特异性不强，单克隆抗体成本较高，且利用抗原和抗体结合原理设计的常规ELISA法都存在背景较高及一定程度的交叉反应，在检测临床血样时往往尤其突出，血液中其他成分严重干扰利妥昔单抗的检测。因此，本领域迫切需要建立一种新的用于检测抗CD20单克隆抗体的背景低、专一性强、灵敏度高、成本低的ELISA方法，以便用于检测生物样品中的CD20单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高特异性和灵敏度的检测抗CD20单克隆抗体的多肽及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种多肽，具有如式I的结构：X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1式I；其中，X0为无，或保护基，或1-10个氨基酸构成的肽段；X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、非人源化抗体、单链抗体、抗体片段。在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体为人-鼠嵌合抗体。在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体来源于哺乳动物，较佳地来源与人或啮齿动物，更佳地，来源于人、小鼠或大鼠。在另一优选例中，所述抗CD20单克隆抗体的最低浓度级别为1×10-1μg/ml。在另一优选例中，所述的保护基包括乙酰基（CH3-CO-）或叔丁氧羰基（Boc）；和/或X0为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段；和/或X1为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段。在另一优选例中，X1为乙酰基。在另一优选例中，所述抗CD20单克隆抗体包括利妥昔单抗(Rituximab)。在另一优选例中，式I多肽中的两个Cys之间形成链内二硫键。在另一优选例中，所述多肽不结合于IBI302或VID等融合蛋白、或等单抗。在另一优选例中，X0或X1不含有Cys残基。本专利技术第二方面，提供了一种偶联物，所述的偶联物是本专利技术第一方面所述多肽与载体蛋白偶联形成的偶联物。在另一优选例中，所述的偶联是通过式I多肽的羧基端偶联的。在另一优选例中，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白或γ球蛋白。在另一优选例中，所述蛋白质载体是血蓝蛋白或牛血清白蛋白。本专利技术第三方面，提供了一种本专利技术第一方面所述多肽或本专利技术第二方面所述偶联物的用途，用于制备检测样品中利妥昔单抗等抗CD20单克隆抗体的试剂、检测板或试剂盒。在另一优选例中，所述样品包括为血液样品、血清样品、组织液样品或单抗药物样品。本专利技术第四方面，提供了一种检测样品中是否含有利妥昔单抗等抗CD20单克隆抗体的方法，包括步骤：(a)将样品与本专利技术第一方面所述的多肽或本专利技术第二方面所述的偶联物接触；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在抗CD20单克隆抗体。本专利技术第五方面，提供了一种本专利技术第四方面所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将样品与本专利技术第一方面所述的多肽或本专利技术第二方面所述的偶联物接触，并且在步骤(b)中通过ELISA法进行检测。本专利技术第六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本专利技术第一方面所述的多肽或本专利技术第二方面所述的偶联物。在另一优选例中，所述的测试条还含有抗体点样区。在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。本专利技术第七方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的本专利技术第一方面所述的多肽或本专利技术第二方面所述的偶联物，或者所述的试剂盒含有本专利技术第六方面所述的检测板。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了CD20-acp肽的结构图。图2显示了CD20-acp肽的制备及偶联操作流程。图3显示了CD20-acp-BSA-ELISA法测定利妥昔单抗的选择性试验结果。将CD20-acp-BSA包被，浓度为100μg/孔。用含有10%人血清的IBI302、Avastin、VID、Humira和利妥昔单抗(Rituximab)等5种单克隆抗体药物（浓度为100μg/mL）做受检样品，HRP-羊抗鼠作为二抗测OD450nm吸收值。结果表明，以CD20-acp-BSA为包被物，对于利妥昔单抗单克隆抗体有高度特异性，与其它人源的抗体没有明显特异性结合，不与二抗产生明显的交叉反应，对人血清有很强的抗干扰能力。图4显示了CD20-acp-BSA-ELISA法测定利妥昔单抗的线性范围试验结果。将CD20-acp-BSA包被，浓度为1μg/孔。制备利妥昔单抗单克隆抗体的标准样品，浓度分别为0.122、0.244、0.488、0.976、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、和250μg/mL。结果表明，在0.122-250μg/mL范围内，利妥昔单抗单克隆抗体的浓度的对数值与免疫反应光吸收值（OD450nm值）呈线性关系。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次合成了一种高灵敏度的、高特异性结合生物样本中抗CD20单克隆抗体的多肽，本专利技术多肽及其ELISA方法稳定性强，灵敏度高，特异性强，能够测得样品中1×10-1μg/ml浓度级别的抗CD20单克隆抗体，作为ELISA反应中的抗原底物，从而克服常规ELISA法的背景高、交叉反应大、成本高的缺点，增强检测抗CD20单克隆抗体的专一性，并通过其高灵敏度的特性，能够检测到样品中微量的抗CD20单克隆抗体，从而实现在临床检测中的应用。在此基础上，完成了本专利技术。活性多肽在本专利技术中，术语“本专利技术多肽”、“CD20-acp”、“本专利技术抗CD20单克隆抗体结合肽”可互换使用，均指含有式I结构且能够与抗CD20单克隆抗体特异性结合的多肽，一种优选的本专利技术多肽如SEQIDNO.:1所示。此外，所述术语还包括具有与抗CD20单克隆抗体结合功能的、SEQIDNO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：X0为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段；和/或X1为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，具有如式I的结构：X0‑Cys‑Pro‑Tyr‑Ala‑Asn‑Pro‑Ser‑Leu‑Cys‑X1式I；其中，X0为无，或保护基，或1‑10个氨基酸构成的肽段；X1为无，或1‑10个氨基酸构成的肽段；且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，具有如式I的结构：X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1式I；其中，X0为保护基；X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性；所述的保护基包括乙酰基(CH3-CO-)或叔丁氧羰基(Boc)；式I多肽中的两个Cys之间形成链内二硫键。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的抗CD20单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、非人源化抗体、单链抗体、抗体片段。3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的抗CD20单克隆抗体为人-鼠嵌合抗体。4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的抗CD20单克隆抗体来源于哺乳动物。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述的抗CD20单克隆抗体来源于人或啮齿动物。6.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述的抗CD20单克隆抗体来源于人、小鼠或大鼠。7.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述抗CD20单克隆抗体的最低浓度级别为1×10-1μg/ml。8.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的保护基为乙酰基(CH3-CO-)；和/或X1为8-9个、6-7个、4-5个、2-3个或1-2个氨基酸构成的肽段。9.如权利要求8所述的多肽，其特征在于，X0为乙酰基。10.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述抗CD20单克隆抗体包括利妥昔单抗(Rituximab)。11.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，X1为无。12.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽不结合于IBI302或VID融合蛋白、或单抗。13.一种偶联物，其特征在于，所述的偶联物是权利要求1所述多肽与载体蛋白偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李顺意，俞德超，张丽君，孙左宇，陈娜，李佳，
申请(专利权)人：湖北大学，信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42