一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)”功能蛋白，所述“转录激活子样效应因子”功能蛋白的重复可变的双氨基酸残基RVD(repeat variable di-residues)分别为精氨酸R和缬氨酸V、或者分别为缬氨酸V和异亮氨酸I、或者分别为甘氨酸G和天冬氨酸D、或者分别为精氨酸R和色氨酸W、或者分别为苏氨酸T和甘氨酸G、或者分别为半胱氨酸C和甘氨酸G、或者分别为谷氨酸E和半胱氨酸C。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种“转录激活子样效应因子(Transcript1nActivator LikeEffectors, TALE) ”功能蛋白设计、合成以及上述功能蛋白的应用，特别涉及上述功能蛋白。
技术介绍
在后基因组时代，我们迫切需要高效的基因操纵、合成等新型的生物工程技术。比如，我们常常需要抑制或沉默一个基因的表达。传统的基因敲除(Gene Knockout)技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10_6级；RNAi技术虽然简单易行，但是又很难获得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我们常常还需要针对特定基因，进行某几个碱基，甚至某一段序列的修改。同样只依赖于同源重组技术，很难获得理想的效果。TALE (Transcript1n Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的,特异性地结合到DNA,在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。TALE蛋白可以穿过核膜进入细胞核内与特定的DNA结合域结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。简单讲，TALE是由4个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成，而每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双氨基酸残基(repeat variablediresidue,或者RVDs)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。理论上，针对A、T、G、C任何一个碱基，都能找到与之特定结合的RVDs。因此，对任何一段DNA序列，我们可以方便的设计、合成出对应蛋白模块组成的TALE。需要指出的问题是，I)虽然针对A、T、G、C都可以设计出对应的RVD，但是，它们之间的对应关系还有待于进一步优化；2)设计合成的TALE能否高效地靶向结合基因组上的预期位置，还决定于很多其它因素；3)蛋白模块的组成也有进一步优化的空间。虽然TALE还有很多问题有待于深入研究加以解决，但是这并不妨碍它的应用。一个最大的应用前景是TALEN。TALEN是一个融合蛋白，由与某段DNA序列特异性识别TALE与能在DNA序列上产生双链断裂(double strand break, DSB)的内切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是异源二聚体分子(即两单位的TALE-Nuclease共同作用)，能够在两个相隔较近的特异识别序列间切割DNA。TALEN产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复:1)非同源末端连接(NonHomologous EndJoining7NHEJ):NHEJ是以自然修复机制,能被用来引入核苷酸缺失以便失活或敲除一个特异性的祀基因；2)同源重组(Homologous Recombinat1n,HR):DSB促进同源重组，在一个DNA模版存在下，能够产生特异性DNA序列改变，也能够将转基因整合到DNA序列上。NHEJ途径可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(Gene Knock-1n)。无论是哪种途径，TALEN产生的修复与单纯依赖于同源重组相比,基因发生重组的效率大大提高，这为我们从事基因组订制化(genome customizat1n)提供方便的技术手段，为开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。TALE 另外一个大的应用前景是 TALEA (transcript1n activator-like (TAL)effector activator)。TALEA是一个融合蛋白，将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64Activat1n Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。该融合蛋白将结合基因启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Polymerase II结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列(一般12-18个碱基)，构建TALE识别模块。TALE技术已经开始在生命科学领域崭露头角。2011年，法国和美国两个小组合作，利用TALEN技术，在大鼠中敲除失活IgM功能，效率高达60 %。2011年，包括中国在内的几个小组，利用TALEN技术，在斑马鱼中，敲除失活hey2等基因，效率也达到了 30 %以上。TALE具有特殊的结构特征，包括氮端(N端)分泌信号、中央的DNA结合域、和核定位序列(Nuclear localizat1n signal,NLS)和碳端(C端)的激活域。DNA结合域中，几乎所有已经发现的TALE蛋白都是有数量不同(12?30)、高度保守的重复单元组成，这些重复单元(一般含有33?35个氨基酸)中，除了第12和13位氨基酸不尽相同之外，其他组成部分都十分保守。其中第12和13位可变的氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基RVD (repeat variable d1-residues)。TALE主要是通过重复单兀中的RVD识别DNA序列。目前已经报道的RVD共有14种。NI (天冬酰胺和异亮氨酸)特异性识别A，HD(组氨酸和天冬氨酸)特异性识别C，NN(天冬酰胺和天冬酰胺)可以识别G和A，NK (天冬酰胺和赖氨酸)特异性识别G，NS (天冬酰胺和丝氨酸)可以识别G、A、C和T，NG (天冬酰胺和甘氨酸)特异性识别T，NH(天冬酰胺和组氨酸)特异性识别G，N* (天冬酰胺，第13位空缺)可以识别T、C、G和A，NP (天冬酰胺和脯氨酸)可以识别T、A和C，HN (组氨酸和天冬酰胺)可以识别G和A，NT (天冬酰胺和苏氨酸)可以识别G和A，SN (丝氨酸和天冬酰胺)特异性识别G，SH (丝氨酸和组氨酸)特异性识别G。现有技术存在的问题:有的TALE特异性不够强，有的TALE识别效率不够高。因此，开发新的高效TALE序列(即新的RVD)，就成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的正是为了解决上述技术问题，希望通过设计对TALE蛋白进行一些改进，实现TALE蛋白的RVD序列上的优化，以达到针对A、T、G、C任何一个碱基都有与之特定结合的RVD序列。RV特异性识别A碱基；VI特异性识别C碱基；GD特异性识别C碱基；RW特异性识别C碱基；TG识别T碱基，亦可以较弱识别C和G碱基；CG可以识别G碱基，亦可以较弱识别T和C碱基；EC可以较强识别A、G和C碱基，亦可以较弱识别T碱基。本专利技术采用的技术方案如下。本专利技术中设计针对HHB基因序列设计合成TALEN，采用的实验方法是国际上比较常用的突光素酶单链重组退火实验(luciferase single-strand annealingrecombinat1n assay, SSA),和用来检测内源基因非同源重组检测效率的方法-SURVEYOR实验。实验原理如附图1、2所示。虽然对于识别特异性更好、识别效率更高的新TALE存在普遍的需求，现有技术中也存在测试TALE识别效率的方法(SSA、SURVEYOR，详见下文)，但是自从TALE被发现以来，新结构的TALE却很少本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)”功能蛋白，其特征在于所述“转录激活子样效应因子”功能蛋白的重复可变的双氨基酸残基RVD(repeat variable di‑residues)分别为精氨酸R和缬氨酸V、或者分别为缬氨酸V和异亮氨酸I、或者分别为甘氨酸G和天冬氨酸D、或者分别为精氨酸R和色氨酸W、或者分别为苏氨酸T和甘氨酸G、或者分别为半胱氨酸C和甘氨酸G、或者分别为谷氨酸E和半胱氨酸C。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：席建忠，孙常宏，王干诚，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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