本发明专利技术提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用，采用PCR克隆技术从玉米高活性的Mu品系中获得Mu转座子的相关片段，以双元质粒载体pCAMBIA1300为骨架，分别构建新型高效的双元质粒载体pMuE和pMuDR，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代中筛选出无选择标记基因的转基因植株。本发明专利技术能够提高转基因的转化效率，该载体系统的获得将为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体，尤其可为玉米、水稻等重要粮食作物的无标记基因转化提供可靠、有效的工具，具有重要的理论意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体的说涉及一种玉米新型高效无选择标记转基 因载体系统构建方法及应用。
技术介绍
随着商业化植物转基因品种的不断出现，人们对遗传工程生物的环境安全和食品 安全问题越来越重视。这些问题主要由于抗生素或除草剂抗性的选择标记基因存留于转 基因植物中产生的。随着植物遗传工程的发展，已经产生了大量具有人们所期望性状的农 作物。为了加快作物改良的进展，将外源目的基因导入植物体，并筛选出相对少量的转化细 胞，一个有效的转化系统是极为重要的。到目前为止，被广泛用于选择的标记基因（marker gene)主要是编码抗生素或除草剂抗性的基因，一旦一个完整的转基因植株已经形成，这些 选择标记基因一般说来都是多余的。目前，具有抗生素或除草剂抗性的标记基因在转基因 植物中的存在已引起了人们的广泛关注。其主要原因如下：第一，用于从未转化细胞中筛选 少量的已转化细胞的抗生素或除草剂，一般都会对细胞的发育和分化产生负面的影响，可 能会延迟转化过程中不定芽的分化。第二，当一个转基因植物中已含有一个抗性基因作为 标记基因，在导入第二个目的基因时，要选用不同的选择基因。有许多人们感兴趣的性状和 基因值得被引入到植物中，但能够被实际运用的选择标记基因数量是有限的，因此人们想 要对同一植物品种导入多个基因是很难的。所以，人们期望建立一个系统去除选择标记基 因，以便通过重复转化来增加转基因的数量。第三，从健康及安全角度来看，选择标记基因 及其产物被使用时可能是有毒的或过敏的。人们的担心是，如果抗生素类选择标记基因被 应用于临床或兽医上，它们有可能被转移到微生物中，并且可能会增加在人或动物消化道 内的病原微生物的数量，这将危及抗生素在临床及兽医上的应用。从环境安全方面来看，存 在的问题是：（I)带有抗生素或除草剂抗性标记基因的转基因植物可能会变成有害的杂 草；（II)选择标记基因传播到野生亲缘种中，可能会使杂草获得这些基因而使现有的除 草剂无法将杂草杀掉；（III)选择标记基因传播到其它生物体中，可能会破坏生态系统的平 衡。因此，使转基因植物释放后不带选择标记基因，对从事转基因的工作人员及消费者来 说都是极为重要的。此外，尽管也有安全性评估部门报道，使用新霉素磷酸转移酶（nptII) 作为选择标记基因不存在健康或安全方面的问题。然而，要对其它每一个选择标记基因及 其产物进行安全性评价，将耗费大量物力、财力及时间，影响转基因植物投入市场，一个更 为有效的办法是从宿主基因组中去除掉这些选择标记基因。 因此，获得无选择标记基因的转基因植物是消除上述潜在不利因素的关键。目前 通过以下方法可以获得无选择标记的转基因植物：1)共转化法，将标记基因与目的基因分 别构建到独立的双元载体中或者同一载体两个独立的T-DNA元件，因为T-DNA在导入细胞 的过程中会以多个拷贝的方式导入，通过对标记基因的选择可能同时获得含有目的基因的 转基因植物，通过后代的分离而获得只含有目的基因的转基因植物。然而，这个系统必须符 合以下两个条件：①共转化频率要高；②共转化的DNA在受体细胞中处于不连锁状态.实 际上，位于不同转化载体中的转基因共整合频率往往较低，并且常整合在受体基因组的 同一位点，这就使得共转化的应用受到了限制。2)位点特异重组系统，细菌噬菌体P1重 组系统Cre/loxP包含重组酶Cre和重组酶识别位点loxP两个元件，将选择标记构建到两 个loxP位点之间，目的基因置于loxP位点之外，然后分别将Cre元件和loxP元件导入到 同一植物之中，通过Cre重组酶将选择标记基因从目的基因边上割离，在后代中筛选只含 有目的基因而不含Cre元件及标记基因的转基因植株。3)MAT载体系统，利用异戊烯基转 移酶基因ipt(Isopentenyltransfer-ase)或者发根农杆菌中的rol基因作为正向选择标 记，结合位点特异重组系统，在不加细胞分裂素的分化培养基中获得正常形态的不定芽，再 鉴定获得无标记转基因植株。4)玉米Ac/Ds转座子系统，它是利用可移动的转座子元件Ac 或Ds能从染色体的一个位点转移到另一个位点，然后在后代中通过自交分离获得不含有 标记基因的转基因植株。譬如，Ebinuma等通过将标记基因插入玉米转座子Ac中，获得了 无选择标记的转基因烟草。相对于前面三种方法，利用转座子系统构建无选择标记转基因 载体系统，通过遗传转化和后代分离获得无选择标记的转基因植物方法，在实验过程中操 作简便，利用转座子自身具有的转座特性在遗传杂交过程中更容易分离得到无选择标记的 转基因植株。然而，目前植物中发现的可利用的转座子系统尚还比较缺乏，宄其原因是人们 对植物基因组中存在的大量的各种不同类型的转座子系统的特点，了解得还不够全面。关 于转座子系统的转座特性及其应用的研宄仍有大量的工作需要开展。虽然以Ac/Ds转座子 系统构建无选择标记的转基因载体系统，目前在水稻、烟草等植物中已有报道，但由于受其 转座活性和频率的影响较大，后代中获得无选择标记的转基因植株较少，从而阻碍了该方 法在获得无选择标记转基因植株上的应用。因此，发掘新型的高活性的转座子系统代替Ac/ Ds转座子系统来构建新型的无选择标记的转基因载体系统，将有助于克服这一技术上的障 碍，获得更高转座活性的载体系统，进而获得更多的无选择标记转基因植株，提高转基因的 转化效率。 玉米MuDR/Mu转座子系统是一类目前植物体内发现的转座活性最高的新型植物 转座子系统。Mu转座子因其拷贝数高、正向突变率高、倾向于插入到低拷贝的DNA序列等独 特的遗传特性，已成为玉米基因组学研宄中重要的诱变剂之一。然而，运用MuDR/Mu转座子 系统来构建新型的植物无筛选标记的转基因载体系统获得无标记转基因植株的研宄，目前 国内外还尚未报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体 系统构建方法及应用，克服了现有玉米转座子系统活性不高的难题，同时能够获得更多的 无选择标记转基因植株，提高转基因的转化效率，为后期大规模地转化玉米、水稻等重要粮 食作物，获得安全的和无选择标记的转基因植株提供技术保障。 为了实现上述目的，本专利技术提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构 建方法，包括如下步骤： 步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩 增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I 限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20 (Bar_)载体片段连接获得pAHC20 (Bar_ mudrA+);用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20 (Bar- mudrA+)两者双酶切，前 者回收载体部分，后者回收Ubi-mudrA-Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR ; 步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝 胶电泳、切胶后纯化回收Mul完整片段，用KpnI分别对回收的Mul完整片段本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，包括如下步骤：步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20(Bar－)载体片段连接获得pAHC20(Bar－mudrA+)；用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar－mudrA+)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi‑mudrA‑Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR；步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收Mu1完整片段，用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切，然后进行连接，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1+)；用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒，用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1+)进行单酶切，酶反应后补平粘性末端，然后两者进行连接，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部形成新的双元质粒载体pMuE；步骤三：将质粒载体pMuDR和pMuE分别导入农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代筛选无选择标记基因的转基因植株。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱叶雄，席贻龙，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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