本发明专利技术公开一种氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，属于RNA纳米保护技术领域。氧化石墨烯生产工艺简单，易于获得，价格低廉，性质稳定，便于储存使用，不需要特定的冷冻储存环境，运输方便；将其作为RNA保护剂能有效的降低实验成本。氧化石墨烯RNA保护效应稳定，不会随着放置在室温中时间的增长而急剧降低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于RNA纳米保护
，特别涉及一种基于氧化石墨烯纳米材料吸附功能的RNA保护策略，该方案能够有效的阻断RNA保存过程中酶促降解过程。
技术介绍
核糖核酸(RNA)存在于细胞及部分病毒、类病毒当中，并行使遗传信息载体的功能。其广泛参与各项重要的生命历程，对于生命活动的维系具有重要作用。根据RNA的功能可将RNA大致分为四类:l)mRNA:即信使RNA，主要功能是将DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，以传递遗传信息；2)tRNA:具有特异识别、转运氨基酸功能；3)rRNA:核糖体的重要组成成分。4)microRNA:具有调控功能。由此可见，RNA在生物体内，对于生物体生命活性具有重要意义。为了实现RNA功能探索及生理意义相关研宄，通常需要对RNA进行分离纯化，并将纯化的RNA进行冷冻保存。然后，RNA的易降解性使RNA的保存面临严峻的挑战。目前，研宄者通常采用添加RNA酶抑制剂的方法，人为添加RNA酶抑制剂到RNA溶液当中，以降低或抑制RNA酶的催化活性，从而达到RNA保护的目的。但此类方法所需的RNA酶抑制物往往存在成本很高、运输存储困难、易变质、活性不稳定等问题。因此，开发新型的、易储存运输、活性稳定的RNA保护策略对于RNA保护及相关领域具有重要意义。近年来，随着纳米技术的进步，纳米材料已广泛运用于生命科学领域。其中，氧化石墨烯更是成为了“明星”纳米材料，并广泛运用于电子学、材料学、诊断学等学科。众所周知，氧化石墨烯能够通过π-π堆叠效应，吸附核酸及蛋白质，产生固定化作用，而固定化作用导致的分子自由度的变化可能会引起酶促反应过程的巨变，可以产生酶促反应过程的阻断。正如我们预想的那样，我们在实验过程中发现，在总RNA提取物中加入氧化石墨烯能够延长RNA的储存时间，氧化石墨烯似乎具有RNA保护功能。由此，我们对氧化石墨烯的RNA保护功能进行了深入的研宄，并发现氧化石墨烯通过固定RNA，在其表面形成一个保护界面，可以有效的阻止RNA酶对RNA的降解。同时，我们发现氧化石墨烯能够固定RNA酶，固定后的RNA酶活性明显降低。因此，氧化石墨烯的RNA保护功能是通过对RNA及RNA酶的吸附，阻断了酶促反应过程而实现的。综上，本专利技术发展了氧化石墨烯RNA保护策略，能够克服当前RNA抑制剂保护方法存在的问题，其易于存储运输、性能稳定，通过后续实验发现，氧化石墨稀能够为RNA提供有效的保护。
技术实现思路
为了克服现有RNA保护技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用。本专利技术采用在RNA溶液中加入氧化石墨烯的方法，通过石墨烯的吸附作用，使RNA及RNA酶吸附在氧化石墨烯表面，从而使RNA酶的酶促反应过程得到抑制，达到RNA保护的目的。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，包括如下步骤:将氧化石墨烯与RNA样品或RNA酶进行混合，震荡混匀，并室温放置5?15分钟，得到氧化石墨烯RNA混合液或氧化石墨烯RNA酶混合液；使氧化石墨烯充分吸附RNA，达到保护RNA的目的；所述的氧化石墨稀，与RNA样品的质量比优选为1: (I?10)；所述的氧化石墨稀，与RNA酶的比值优选为I μ g: (I?40U)；所述的氧化石墨烯RNA混合液，在常温下放置4天，RNA基本无降解；所述的氧化石墨烯RNA酶混合液中，RNA酶活性大大降低，从而降低了 RNA酶对RNA的降解能力。所述的氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，包括以下具体步骤:1、总 RNA 提取:(I)选取单增李斯特菌作为研宄对象，取菌液离心去上清(原则上每17个细胞加入ImL TRIZOL，不能超过18个细胞，8000g，4°C离心2min，去掉上清液体，仔细将上清液吸取干净，不要触及EP管底部的细菌)(2)加入250 μ L，20mg/mL的溶菌酶(使用无RNA酶的TE溶解)吹打混匀，放入37°C的水浴锅或者培养箱中孵育lOmin。(3)再加入ImL TRIZOL裂解液吹打混匀，再使用振荡器震荡，放置在常温下6?1mino ( 一定要室温静置，静置完毕后可以直接放入_80°C冰箱保存)。(4)往步骤(3)中已经备好的裂解液中加入氯仿(TRIZOL 1/5的体积量，一般200 μ L左右，最多300 μ L)盖紧离心管盖，剧烈震荡，直到将混合液乳化成乳白色状态。室温静置5min。(5)将上层无色液体转移至一新的离心管中(上层液体吸取时尽量使用200 μ L的枪头，尽量不要吸取到中间蛋白层，一般取600 μ L足矣)。(6)向吸取的上清液中加入0.5?I倍体积的异丙醇(最多750 μ L，并且异丙醇要置入-20°C冰箱中提前预冷)，上下颠倒混匀后，4°C静置lOmin。12000g，4°C离心lOmin。(7)小心去掉上清液(先倾倒出液体，再使用200 μ L的枪头将剩余的异丙醇吸掉，在吸取异丙醇的时候一定不要触及底部的RNA沉淀，宁可剩余一点异丙醇在EP管内)，加入75%的乙醇约1.5mL，(乙醇一定要在_20°C预冷，使用DEPC处理水配制)，尽量吹打3?5次，然后再振荡器再使用振荡器震荡3?5次(每次I?2s，动作不能太剧烈，再轻弹管壁使得RNA悬浮起来。)，7500g，4°C离心5min。(8)打开离心管盖，室温干燥5?1min(打开操作台上的风扇吹，切不可太干)，干燥完毕后，加入适量的无RNA酶水或者DEPC处理水溶解(一般取50 μ L，反复吹打溶解，清洗EP管底部的位置30?50次左右)，得到总RNA提取原液。(9)电泳检测并评估提取总RNA的纯度和保存完好程度。步骤⑴中所述的单增李斯特菌细胞数量优选17个；步骤⑵所述的溶菌酶需要严格防止RNA酶的污染，以免对实验产生干扰；步骤(3)中所用TRIZOL试剂优选Life Technologies品牌；步骤(5)中所述的离心管需要用DEPC处理；步骤(6)中所述的异丙醇需要在_20°C冰箱预冷，预冷时间优选24小时；步骤(8)中RNA干燥方式优选风扇干燥，以免是RNA无法溶解；步骤(9)中所述的电泳过程中所涉及的所有电泳试剂、器皿都需要用DEPC处理；2、氧化石墨烯RNA保护原理探宄(I)验证RNA酶能否降解被氧化石墨烯吸附的RNA ①取步骤I中所得总RNA提取物。②取IyL氧化石墨稀(lmg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入39 μ L无RNA酶的水补足至90 μ L，震荡混匀，并室温放置5?15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。所述的氧化石墨稀与总RNA的质量比优选为1: (I?10)。③向上述混合体系中，加入RNA酶10 μ L，充分混匀，并37 °C孵育30分钟，得反应液。④配制I %的琼脂糖凝胶，冷却备用。⑤取出步骤③中反应液8 μ L，加入10 X RNA荧光染料(SYBR Gold) 2 μ L，混匀并染色lOmin。然后，再加入电泳载样缓冲液(Loading Buffer，6X) 2 μ L，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。⑥取步骤④中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤⑤所述混合液的电泳分析(电压:120V,45min)。⑦凝胶成像，并观察记录实验结果。通过电泳结果验证石墨烯吸附的本文档来自技高网...
【技术保护点】
氧化石墨烯作为RNA保护试剂的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，邢达，廖玉辉，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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