一种草莓基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种草莓基因组DNA的提取方法，用液氮将样品麿成粉末，加入CTAB提取液，55～65℃水浴后冷却至室温，加入醋酸钾后冰浴，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心，再在所得上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液；在上清液中加入异丙醇后，离心得沉淀物；离心后去除上清液，加入含RNase的TE缓冲液在37℃水浴，然后加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液，向上清液中加入醋酸钠和无水乙醇后，离心去除上清液，向沉淀中加入TE缓冲液溶解沉淀，即为草莓基因组DNA溶液。本发明专利技术综合了CTAB和SDS提取方法的特点，最终得到高糖多酚类植物草莓高质量的基因组DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种草莓基因组DNA的提取方法。
技术介绍
草莓是一种蔷薇科多年生草本植物，一年可以多次开花结果，是我国冬季重要的一种时令水果。草莓叶片和果实中含有丰富的多糖、蛋白质、酚酸、维生素等次生物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。因为这些粘性极强的次生物会与DNA共沉淀或者捆绑在一起，严重影响了 DNA质量，导致后续的扩增、酶切等分子生物学难以进行。高质量基因组DNA的提取分离是分子生物学研宄的基础，常用的基因组DNA最基本的提取方法有:CTAB法和SDS法，其它如试剂盒法、高盐法等都是在这2种方法的基础上进行的改良或简化。这几种方法对极细嫩的组织会有效，但对于老叶片，果实，往往最后得到的DNA样品非常粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，缠搅在其中的粘性物致使DNA检测时上样困难、电泳困难。凝胶电泳检测显示DNA得率很低，上样孔或样道非常亮(见图1?2)。因此，开发一种适合草莓DNA提取的方法，能大大方便地进行分子生物学操作。
技术实现思路
本专利技术针对现有中的缺点，公开了一种草莓基因组DNA的提取方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决。一种草莓基因组DNA的提取方法，包括以下步骤，(I)将CTAB提取液预热到55?65°C，每Ig草莓果实或叶片粉末中加入5?1ml预热后的CTAB提取液，在55?65°C下保温30?60分钟，其间晃动3?4次使其混合，得到混合物I ;在粉末中加入预热过的CTAB提取液，在60?65°C下保温30?60分钟，晃动3?4次，使其充分混合。(2)将步骤⑴中的混合物I中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(I)中CTAB提取液体积的1/4?1/3，冰浴条件下放置l_2h，得到混合物II ;(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物II等体积；混合后在2-5°C离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5°C离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相I ;(4)向步骤(3)所得的中间相I中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相I体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40?100 μ g/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37°C的水浴中反应30?60min，得到混合物II ；(6)向混合物II中加入混合物II等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5°C离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5°C离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相II ;(7)取步骤(6)所得的中间相II，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相II体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相II体积的2倍；_20°C放置30?60min，然后在2-5°C离心，收集沉淀物；(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。作为优选，步骤(I)中，CTAB提取液包括，1-3 % (m/V)的CTAB，80-120mM的Tris-HCl, 10-25mM 的 EDTA, 1-2M 的 NaCl 和 1-3% 的 PVP ；CTAB 提取液的 pH 值为 7.5-8.5。作为优选，CTAB提取液包括，2% (m/V)的 CTAB，10mM 的 Tris-HCl，20mM 的 EDTA，1.4M的NaCl和2%的PVP ；CTAB提取液的pH值为8.0。作为优选，将CTAB提取液在110-120 °C灭菌20_40min，使用时在每10mlCTAB提取液中加入l_3ml的β -巯基乙醇。作为优选，步骤(7)中，乙醇为无水乙醇。作为优选，氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。作为优选，离心时，转速控制在10000?12000rpm，离心10?15分钟。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:本专利技术综合了 CTAB法和SDS提取方法的特点，利用CTAB的高裂解力和去除多糖的效果，加上SDS法提取DNA中的，高盐浓度(醋酸钾)和降低温度(冰上保温)的办法沉淀除去蛋白质和多糖(在低温条件下醋酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿/异戊醇抽提，反复抽提后用异丙醇沉淀，再用Rnase去除RNA后用氯仿/异戊醇抽提，再用乙醇沉淀水相中的DNA，得到高质量的与杂质彻底分离的草莓基因组DNA。经检测用本专利技术方法得到的草莓基因组DNA质量较高；用该草莓基因组DNA进行PCR扩增，得到较好的扩增结果。进而，本专利技术解决了草莓次生物含量高导致的高质量DNA提取困难的问题。【附图说明】图1是传统CTAB法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。图2是传统SDS法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。图3是本专利技术方法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。图4是本专利技术方法提取的DNA的检测草莓镶脉病毒的凝胶电泳检测图片。图5是本专利技术、传统CTAB法、传统SDS法提取的草莓DNA凝胶电泳检测结果对比图。【具体实施方式】实施例1一种草莓基因组DNA的提取方法，CTAB提取液包括，I % (m/V)的CTAB，80mM的Tris-HCl，1mM 的 EDTA，IM 的 NaCl 和 I % 的 PVP ；CTAB 提取液的 pH 值为 7.5。将 CTAB 提取液在110°C灭菌20min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入Iml的β -巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。包括以下步骤，(I)将CTAB提取液预热到55°C，每Ig草莓果实或叶片粉末中加入5ml预热后的CTAB提取液，在55°C下保温30分钟，其间晃动3次使其混合，得到混合物I ;(2)将步骤(I)中的混合物I中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(I)中CTAB提取液体积的1/4，冰浴条件下放置lh，得到混合物II ;(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物II等体积；混合后在2°C离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2°C离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相I ;(4)向步骤(3)所得的中间相I中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相I体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40 μ g/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37°C的水浴中反应30min，得到混合物II ；(6)向混合物II中加入混合物II等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2°C离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2°C离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相II ;(7)取步骤(6)所得的中间相II，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相II体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相II体积的2倍；-20°C放置30min，然后在2°C离心，收集沉淀物；(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)将CTAB提取液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的CTAB提取液，在55～65℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次使其混合，得到混合物Ⅰ；(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4～1/3，冰浴条件下放置1‑2h，得到混合物Ⅱ；(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2‑5℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2‑5℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40～100μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应30～60min，得到混合物Ⅱ；(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2‑5℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2‑5℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；‑20℃放置30～60min，然后在2‑5℃离心，收集沉淀物；(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苗立祥，张豫超，蒋桂华，杨肖芳，肖金平，王月志，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33