本发明专利技术公开了葡萄枝条RNA的提取方法，包括以下步骤：称取样品加入聚乙烯吡咯烷酮以液氮研磨，加入CTAB提取液和β-巯基乙醇，金属浴后混匀；混匀后放在冰上加入醋酸钾溶液和2-丁氧乙醇，混匀静置；再加入CHCl3离心；离心液取上清加入CHCl3，再次离心；离心液取上清，加入预冷的异丙醇，冰浴条件下放置30min；离心后弃上清，沉淀用预冷75%乙醇漂洗一次；离心后弃上清，将离心管风干；再加DEPC-H2O溶解即可。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的葡萄枝条RNA的提取方法，获得了高质量的RNA，可以满足葡萄SSH分析、转录组测序、生物信息学分析等对RNA质量的要求。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】葡萄枝条RNA的提取方法
本专利技术涉及葡萄枝条RNA的提取方法。
技术介绍
获得完整性好、纯度高的总RNA是开展葡萄功能基因的克隆、分子表达机理和生物信息学研宄的前提。植物RNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、氯化锂沉淀法、异硫氰酸胍法、Trizol法、Bizol法等。由于葡萄组织结构的特殊性及组织中多糖、多酚等物质含量较高，用这些方法很难提取到高质量的RNA。葡萄枝条是研宄葡萄抗逆性和生长发育规律的重要材料，从枝条韧皮部和形成层提取RNA是目前葡萄分子生物学研宄的一个重要方面。近年来，商业化RNA提取试剂盒在一些植物样品RNA提取中已被证明具有简单快捷、试验重复性较好的优点，但在葡萄枝条中很难提取到高质量的RNA，甚至提取不到葡萄RNA。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，利用CTAB对葡萄细胞裂解效果好的特点，从抑制提取过程中组多酚物质的氧化褐变、利用2-丁氧乙醇除去多糖等方面着手，提供了一种葡萄枝条RNA的提取方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:葡萄枝条RNA的提取方法，包括以下步骤:1)称取0.2g葡萄韧皮部与形成层混合样置入研钵中，加入聚乙烯吡咯烷酮固体粉末0.02 g后，迅速倒入液氮进行充分研磨，然后将粉末转入2 ml离心管中，加入预热至65°C的2 % CTAB提取液700 μ I和20°C的β -巯基乙醇20 μ 1，颠倒混匀后，在65°C金属浴30min，每隔5 min取出涡旋混匀I次； 2)取出步骤I)得到的涡旋混匀后的离心管放在冰上，迅速加入5M醋酸钾溶液300μ I和2- 丁氧乙醇300 μ 1，涡旋振荡，混匀后在-20 °C条件下静置30min ;3)在步骤2)得到的静置后离心管中，加入200μ I CHCl3，4°C、15000rpm离心10 min ；4)将步骤3)得到的离心液，取上清，加入800μ I CHCl3,4°C、12000rpm离心10 min ； 5)将步骤4)得到的离心液，取上清，并加入吸取的上清液体积1.5倍的-20°C预冷的异丙醇，在冰浴条件下放置30 min ； 6)将步骤5)中得到的冰浴后的混合液，在4°C、12000rpm离心10 min，弃上清，沉淀用-20°C预冷的75 %乙醇漂洗一次； 7)将步骤6)得到的漂洗后溶液，在4°C、5000rpm离心3 min,弃上清，在超净工作台上，将离心管倒置在无菌滤纸上吸干管壁内液体后，在超净台上风干2min ;8)在步骤7)得到的风干后离心管中，加DEPC-H2O50 μ I溶解，_80°C保存备用。本专利技术所用主要试剂的配制: ①1.0M Tris-HCl:称取12.1g Tris碱溶于80 ml DEPC水中，用4.2 ml盐酸浓盐酸调节pH为8.0，用DEPC水定容至100 ml，灭菌备用。②5M KAc溶液:称取49.07g醋酸钾固体，加入40 ml DEPC水充分溶解后，加入5ml冰乙酸调节pH为5.8，用DEPC水定容至100 ml。③0.5M EDTA 溶液:称取 18.61g Na2-EDTA.2H20，加 80 ml DEPC 水充分溶解后，加入约3.3g NaOH颗粒调节pH为8.0，用DEPC水定容至100 ml，灭菌备用。④2%CTAB 提取液:称取 2g CTAB 固体，加入 1ml 1.0M Tris_HCl、5ml 0.5MEDTAU 1.7g NaCl，充分溶解后用DEPC水定容至100ml，灭菌后使用。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的葡萄枝条RNA的提取方法，是利用CTAB对葡萄细胞裂解效果好的特点，从抑制提取过程中组多酚物质的氧化褐变、利用2- 丁氧乙醇除去多糖等方面着手，建立的葡萄枝条RNA的高效提取方法，此方法获得了高质量的RNA，可以满足葡萄SSH分析、转录组测序、生物信息学分析等对RNA质量的要求。经本专利技术提取方法提取的RNA，具有以下优点: ①经过紫外分光光度法检测表明，所提取RNA的A260 /A280在2.0左右，说明RNA的纯度较高。②1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图1所示)，28S rRNA和18S rRNA的条带清晰，且28S亮度明显高于18S，说明用该方法提取的总RNA无降解、质量高。③用TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit商品试剂盒，不能从葡萄枝条组织中提取到RNA (如图1所示)。【附图说明】图1为米用本专利技术提供的RNA提取方法后进彳丁电泳检测和米用TIANGENRNAsimple Total RNA Kit商品试剂盒进行RNA提取后进行电泳检测的结果对比图。其中，试验材料为红地球葡萄茎段木质部和形成层混合样，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带1、条带2为本专利技术提供的方法提取RNA电泳图，条带3、条带4为用TIANGENRNAsimple Total RNA Kit商品试剂盒提取，可以看出，采用商品试剂盒不能从葡萄枝条组织中提取到RNA。【具体实施方式】实施例1: 葡萄枝条RNA的提取方法，包括以下步骤:1)称取0.2g葡萄韧皮部与形成层混合样置入研钵中，加入聚乙烯吡咯烷酮固体粉末0.02 g后，迅速倒入液氮进行充分研磨，然后将粉末转入2 ml离心管中，加入预热至65°C的2 % CTAB提取液700 μ I和20°C的β -巯基乙醇20 μ 1，颠倒混匀后，在65°C金属浴30min，每隔5 min取出涡旋混匀I次； 2)取出步骤I)得到的涡旋混匀后的离心管放在冰上，迅速加入5M醋酸钾溶液300μ I和2- 丁氧乙醇300 μ 1，涡旋振荡，混匀后在-20 °C条件下静置30min ;3)在步骤2)得到的静置后离心管中，加入200μ I CHCl3，4°C、15000rpm离心10 min ； 4)将步骤3)得到的离心液，取上清，加入800μ I CHCl3,4°C、12000rpm离心10 min ； 5)将步骤4)得到的离心液，取上清，并加入吸取的上清液体积1.5倍的-20°C预冷的异丙醇，在冰浴条件下放置30 min ； 6)将步骤5)中得到的冰浴后的混合液，在4°C、12000rpm离心10 min，弃上清，沉淀用-20°C预冷的75 %乙醇漂洗一次； 7)将步骤6)得到的漂洗后溶液，在4°C、5000rpm离心3 min,弃上清，在超净工作台上，将离心管倒置在无菌滤纸上吸干管壁内液体后，在超净台上风干2min ; 8)在步骤7)得到的风干后离心管中，加DEPC-H2O50 μ I溶解，_80°C保存备用。如图1所示，用TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit商品试剂盒，不能从葡萄枝条组织中提取到RNA。本专利技术技术要点: 1、对生长期幼嫩的葡萄枝条，可以直接用刀片刮取韧皮部和形成层提取RNA;对成熟的枝条或休眠期采集的枝条，先用刀片去掉已经死亡的外皮层，然后再刮取呈绿色的韧皮部组织。2、由于葡萄组织结构的特殊性，很多植物核酸提取的裂解液不能有效的裂解释放核酸，导致不能有效的提取葡萄组织中的RNA，这也是很多商品试剂盒不能提取葡萄RNA的主要原因。本方法采用CTAB能很好的裂解葡萄枝条组织细胞，但本文档来自技高网...
【技术保护点】
葡萄枝条RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1）称取0.2g葡萄韧皮部与形成层混合样置入研钵中，加入聚乙烯吡咯烷酮固体粉末0.02 g后，迅速倒入液氮进行充分研磨，然后将粉末转入2 ml离心管中，加入预热至65℃的2 % CTAB提取液700 μl和20℃的β‑巯基乙醇20μl，颠倒混匀后，在65℃金属浴30min，每隔5 min取出涡旋混匀1次；2）取出步骤1）得到的涡旋混匀后的离心管放在冰上，迅速加入5M 醋酸钾溶液300μl和2‑丁氧乙醇300μl，涡旋振荡，混匀后在‑20 ℃条件下静置30min；3）在步骤2）得到的静置后离心管中，加入200 μl CHCl3，4℃、15000rpm离心10 min；4）将步骤3）得到的离心液，取上清，加入800 μl CHCl3，4℃、12000rpm 离心10 min；5）将步骤4）得到的离心液，取上清，并加入吸取的上清液体积1.5 倍的‑20℃预冷的异丙醇，在冰浴条件下放置30 min；6）将步骤5）中得到的冰浴后的混合液，在4℃、12000 rpm 离心10 min，弃上清，沉淀用‑20℃预冷的75 %乙醇漂洗一次；7）将步骤6）得到的漂洗后溶液，在4℃、5000 rpm离心3 min，弃上清，在超净工作台上，将离心管倒置在无菌滤纸上吸干管壁内液体后，在超净台上风干2min；8）在步骤7）得到的风干后离心管中，加DEPC‑H2O 50 μl溶解，‑80℃保存备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛娟，陈佰鸿，申鹏，马宗桓，米宝琴，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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