一种具有抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法。该方法利用不同酸碱条件下，透明质酸钠分子中不同的基团被活化，进而控制不同的酸碱条件在透明质酸钠分子中引入透明质酸酶抑制剂，最终得到具有抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶。该专利制备出的交联透明质酸钠凝胶相比传统工艺制备的凝胶具有粘度低、体内残留时间长等优点，同时能够的抑制透明质酸酶活性，最高抑制率可达65%。该专利制备的交联透明质酸钠凝胶的低粘度保证了临床的使用的方便性，抑制透明质酸酶活显著提高了体内的残留时间，在注射美容、人工玻璃体以及退变形关节炎补充治疗方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法，本专利技术首先将透明质酸酶抑制物通过共价键结合在透明质酸钠凝胶分子上，然后进行二次交联形成凝胶，该凝胶可用于软组织填充、人工玻璃体、关节腔润滑液补充、药物缓释载体等，属于医疗领域。 技术背景透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰-氨基葡萄糖双糖重复单元组成的线性高分多糖，广泛分布于哺乳动物的结缔组织、玻璃体、胎盘等器官和组织中。透明质酸具有良好的生物相容性和无免疫原性，广泛应用于医疗、美容、化妆品等领域。但由于人体内含有特异性的透明质酸酶，天然透明质酸钠凝胶在体内会被迅速降解、代谢。交联透明质酸钠是透明质酸钠通过化学交联修饰得到的高分子凝胶，弥补了透明质酸钠存留时间短的弊端，而传统的交联透明质酸钠凝胶多为颗粒状或粘度过大，推挤力较大，很难通过小口径注射器针头等，限制了其进一步的拓展应用。现如今市场上出现的透明质酸钠凝胶产品多采用二乙烯基砜（DVS）、1，4-丁二醇双缩水甘油醚（BDDE）等作为交联剂，为了追求更长的体内降解时间，往往增加交联剂的加入量，提高产品的交联度，但上述交联剂多具有毒性或致癌性，残留交联剂进入体内，会造成很大的风险，同时在现有的制备工艺在透析过程中，由于交联后的透明质酸钠凝胶为三维网状立体结构，交联剂包埋其中，很难去除干净；因此，为了提高产品的生物安全性，需减少交联剂的加入量，但这样同时会影响产品的交联度，并最终影响产品的体内残留时间。针对上述一个看似矛盾的难题，目前还没有出现相关的专利来阐述上述问题，本专利技术就针对这对矛盾体，从另外一个角度来解决该问题。体内植入交联透明质酸钠凝胶后的残留时间本质上是体内透明质酸酶的降解作用，传统的专利中提高体内残留时间主要是通过提高交联度来延长残留时间，而本专利另辟蹊径，将透明质酸酶抑制物共价结合到透明质酸钠凝胶分子上，通过抑制体内透明质酸酶的活性来达到延长体内的残留时间。本专利技术采用BDDE或DVS作为交联剂，首先在酸性条件下利用透明质酸钠分子中被活化的羧基，将含有羧基的酶抑制物共价交联至透明质酸钠凝胶分子上，然后再加入天然透明质酸钠凝胶，调整至碱性利用碱性条件下羟基被活化的特点，将含有酶抑制剂的透明质酸钠分子进行交联，再通过酒精沉淀，得到含有酶抑制剂的交联透明质酸钠干粉，PBS复溶得到含有透明质酸酶抑制剂的交联透明质酸钠凝胶。该方法制备的交联透明质酸钠凝胶中含有透明质酸酶抑制剂，可以有效降抑制透明质酸酶的活性，进而延长体内的残留时间。以往的交联透明质酸凝胶的制备方法（如专利CN 101036808，专利CN1950039等）得到的凝胶均为不溶于水的固体凝胶，需要通过制备为具有一定直径的微粒后才能使用，本专利技术专利提供的方法各个步骤都在均一的水相环境下进行，通过酒精沉淀可以最大限度地去除未反应的交联剂，提高产品的生物安全性。 
技术实现思路
专利技术优点1.      本专利技术中引入了透明质酸钠酶抑制剂，植入体内后可以有效抑制透明质酸酶的活性。2.      本专利技术通过酒精沉淀和透析相结合的方法去除未反应的交联剂。3.      本专利技术分别在酸性和碱性条件下进行二次交联反应，提高了交联剂的利用率降低了体内长期植入后的风险，提高了体内使用的生物安全性。为实现以上目的，本专利技术提供的技术方案为：第一步：透明质酸钠溶液的配置第二步：酸性交联反应第三步：碱性交联反应第四步：酒精沉淀第五步：沉淀干粉的复溶第六步：透析。附图说明图1 不同γ-聚谷氨酸含量的交联透明质酸钠凝胶对透明质酸酶活性的影响。 具体实施方式现结合实施例，对本专利技术作了详细描述：实施例一称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉10g，分子量为100万的γ-聚谷氨酸干粉5g，采用100ml含有0.5g1,4-丁二醇二缩水甘油醚的0.5%（w/w）的盐酸溶液将其溶剂，然后室温25℃反应24小时，得到酸性交联凝胶。然后在酸性交联凝胶中加入100ml浓度为1%的氢氧化钠溶液，溶解均匀后，放入5℃恒温恒湿反应柜中反应7天后，得到碱性交联凝胶。采用0.5%氢氧化钠将二次交联凝胶稀释到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗涤2遍。然后采用磷酸盐缓冲溶液将得到的干粉溶解到400ml，溶解均匀后装透析袋透析3天，得到样品1。实施例二称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉12g，分子量为100万的γ-聚谷氨酸干粉5g，采用100ml含有0.5g1,4-丁二醇二缩水甘油醚的0.5%（w/w）的盐酸溶液将其溶剂，然后室温25℃反应48小时，得到酸性交联凝胶。然后在酸性交联凝胶中加入100ml浓度为1%的氢氧化钾溶液，溶解均匀后，放入5℃恒温恒湿反应柜中反应7天后，得到碱性交联凝胶。采用0.5%氢氧化钾将二次交联凝胶稀释到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗涤2遍。然后采用磷酸盐缓冲溶液将得到的干粉溶解到400ml，溶解均匀后装透析袋透析5天，得到样品2。实施例三称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉12g，分子量为100万的γ-聚谷氨酸干粉5g，采用100ml含有0.5g1,4-丁二醇二缩水甘油醚的0.5%（w/w）的盐酸溶液将其溶剂，然后室温25℃反应48小时，得到酸性交联凝胶。然后在酸性交联凝胶中加入100ml浓度为1%的氢氧化钾溶液，溶解均匀后，放入5℃恒温恒湿反应柜中反应5天后，得到碱性交联凝胶。采用0.5%氢氧化钾将二次交联凝胶稀释到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗涤2遍。然后采用磷酸盐缓冲溶液将得到的干粉溶解到400ml，溶解均匀后装透析袋透析5天，得到样品3。实施例四称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉10g，分子量为100万的γ-聚谷氨酸干粉5g，采用100ml含有0.5g1,4-丁二醇二缩水甘油醚的0.5%（w/w）的盐酸溶液将其溶剂，然后室温25℃反应24小时，得到酸性交联凝胶。然后在酸性交联凝胶中加入100ml浓度为1%的氢氧化钠溶液，溶解均匀后，放入5℃恒温恒湿反应柜中反应5天后，得到碱性交联凝胶。采用0.5%氢氧化钠将二次交联凝胶稀释到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗涤2遍。然后采用磷酸盐缓冲溶液将得到的干粉溶解到400ml，溶解均匀后装透析袋透析3天，得到样品4。对比实施例一称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉6.4g，采用100ml蒸馏水溶解后，加入浓度为25%的碳酸钠溶液25ml低温碱化过夜。然后加入二乙烯基砜0.35g，搅拌均匀后放入40℃恒温恒湿反应柜中反应4小时，切成小块透析6天后，粉碎得到对比样品1。对比实施例二称取分子量为120万道尔顿的透明质酸钠干粉10g，采用0.3g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚的50ml浓度为1.5%的氢氧化钠溶液溶解均匀，放入5℃恒温恒湿反应柜中反应7天，切成小块透析至500ml，然后粉碎，得到交联透明质酸钠凝胶微粒，为对比样品2。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于控制透明质酸钠分子不同的活化基团以及不同的交联时间，在交联透明质酸钠分子中引入透明质酸酶抑制剂；首先酸性条件下将透明质酸酶抑制剂引入透明质酸钠分子，然后再在碱性条件下将引入透明质酸酶抑制剂的透明质酸钠分子进行交联反应，最后通过酒精沉淀得到含有透明质酸酶抑制剂的交联透明质酸钠干粉，随后用磷酸缓冲液（PBS）重新溶解得到交联透明质酸钠凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于控制透明质酸钠分子不同的活化基团以及不同的交联时间，在交联透明质酸钠分子中引入透明质酸酶抑制剂；首先酸性条件下将透明质酸酶抑制剂引入透明质酸钠分子，然后再在碱性条件下将引入透明质酸酶抑制剂的透明质酸钠分子进行交联反应，最后通过酒精沉淀得到含有透明质酸酶抑制剂的交联透明质酸钠干粉，随后用磷酸缓冲液（PBS）重新溶解得到交联透明质酸钠凝胶。
2.权利要求1中所述的透明质酸酶抑制剂是指γ-聚谷氨酸、肝素钠等含有羧基的透明质酸酶抑制物。
3.权利要求1中所述的交联...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏长征，朱彬，李莉莉，奚宏伟，
申请(专利权)人：上海其胜生物制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31