本发明专利技术公开了一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物，rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，rTRAIL突变体三聚体上偶联有单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺以及带连接臂的海兔毒素。本发明专利技术偶联物比rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物具有更强的肿瘤细胞杀伤能力，比rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物具有更长的半衰期；表明在本发明专利技术偶联物中，单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、rTRAIL突变体三聚体、海兔毒素并非是单独发挥各自作用的，三者之间产生了较强的协同作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和药物领域，具体涉及一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚 体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子（TNF)相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子， 为一种抗癌应用前景良好的生物药物。 TRAIL在免疫系统细胞中表达，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞，并且 位于细胞膜中，可经半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通过与与其细胞膜受体结 合发挥诱导凋亡作用的。目前已发现5种TRAIL受体，包括：TRAIL-R1 (DR4, TNFSFlOa)和 TRAIL-R2(DR5, TNFRSFlOb) ;TRAIL-R3(DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4(DcR2, TNFRSFlOd); 循环骨保护素（〇PG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡结构域（DD)，是TRAIL结合受 体后诱导凋亡所必需的。其余三个受体由于缺乏功能性死亡结构域，虽然能与TRAIL结合， 但无法诱导凋亡。 TRAIL与DR4或DR5结合后可激活线粒体依赖和非线粒体依赖两条细胞凋亡信号 途径，介导死亡信号传导入细胞内，启动效应物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最终引起肿瘤 细胞凋亡。 近年来，人们发现重组可溶TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系凋亡，但同时也存 在一些对TRAIL敏感性较低或耐受的肿瘤细胞，如所有的人黑色素瘤细胞系、大部分乳腺 癌细胞系、前列腺癌细胞系LNcaP等，这些细胞表面虽然或多或少也表达DR4或DR5,却由 于细胞内凋亡途径中关键酶的缺失、突变和其他抑制凋亡的蛋白高表达等原因，导致TRAIL 结合DR4或DR5之后并不能引起细胞的最终凋亡。 研宄发现，可溶型重组TRAIL(rTRAIL)与放化疗联合应用能提高肿瘤细胞对 rTRAIL的敏感性，二者具有协同作用。目前国际通用的rTRAIL是95~281位氨基酸片段， rTRAIL单体倾向于形成生物活性较好的三聚体而存在，在三聚体的顶部有一个锌离子结合 位点，对稳定三聚体构象起重要作用。 如授权公告号为CN 102936281 B的中国专利文献公开了一种rTRAIL突变体及其 海兔毒素偶联物，该偶联物rTRAIL突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体特异结合，将MMAE定 向转运到肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内释放发挥作用，既可杀伤对TRAIL敏感性低甚至抵抗 的肿瘤细胞，也减少MMAE单独给药产生的毒副作用。 该偶联物的不足之处在于，rTRAIL本身的半衰期非常短，在啮齿类动物中的半衰 期仅为3到5分钟且在非人类的灵长类动物中的半衰期为23到30分钟。rTRAIL与海兔 毒素偶联后，因产物的分子量增加有限（1316Da)，很难改进rTRAIL半衰期短的缺点。针对 rTRAIL-MMAE偶联物半衰期短的缺点，亟需进一步的改造以改善其药代动力学性质，提高偶 联物的成药性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物，该偶联物 不仅具有良好的抗肿瘤效应，还具有较长的半衰期。 一种聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物，rTRAIL突变体的氨基酸 序列如SEQ ID No. 1所示，所述rTRAIL突变体三聚体上偶联有单甲氧基聚乙二醇马来酰亚 胺以及带连接臂的海兔毒素。 单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺使得本专利技术偶联物具有更好的药代动力学性质，如 更长的半衰期，更高的生物利用度；而海兔毒素则使得本专利技术偶联物有更强的杀伤肿瘤细 胞的能力。并且试验发现，本专利技术偶联物比rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物（授权 公告号为CN 102936281 B)具有更强的肿瘤细胞杀伤能力，比rTRAIL突变体-单甲基化聚 乙二醇马来酰亚胺偶联物（授权公告号为CN 103408654 B)具有更长的半衰期。表明在本 专利技术偶联物中，单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、rTRAIL突变体三聚体、海兔毒素并非是单独 发挥各自作用的，三者之间产生了较强的协同作用。 与授权公告号为CN 102936281 B、CN 103408654 B的中国专利技术专利相同，本发 明的rTRAIL突变体取自全长TRAIL蛋白的第95~281个氨基酸，且第109位的天冬酰胺 (Asn)突变为半胱氨酸（Cys)。 在rTRAIL突变体三聚体中，三个半胱氨酸残基的巯基均呈游离态，用于偶联单甲 氧基聚乙二醇马来酰亚胺或带连接臂的海兔毒素，偶联后，每个三聚体可以结合1-2个PEG 分子和1-2个MMAE分子，因此本专利技术偶联物中，rTRAIL突变体三聚体、单甲氧基聚乙二醇 马来酰亚胺、带连接臂的海兔毒素的摩尔比为I: (1~2) : (2~1)。在不同的摩尔比下，偶 联物的肿瘤细胞杀伤能力或半衰期会有所不同。 其中，当rTRAIL突变体三聚体、单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、带连接臂的海兔 毒素的摩尔比1:2:1时，偶联物的半衰期为最长；而当三者的摩尔比为1:1:2时，偶联物的 抗肿瘤活性最强。 综合考虑半衰期和抗肿瘤活性这两个指标，作为优选，本专利技术偶联物中，rTRAIL 突变体三聚体、单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、带连接臂的海兔毒素的摩尔比为1:1:2或 1:1:1 ;更优选为1:1:2。 作为优选，所述单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为3000~15000Da。作为 优选，所述连接臂为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽。单甲氧基聚乙二醇马来酰亚 胺以及上述连接臂均通过马来酰亚胺基团与rTRAIL突变体上的疏基反应形成硫醚键而实 现偶联。 所述连接臂的合成方法、带连接臂的海兔毒素的合成方法参见授权公告号为CN 102936281 B的中国专利技术专利记载的相关内容。 本专利技术还提供了所述聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体-海兔毒素偶联物的制备方 法，包括以下步骤： (1)将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体； 具体为：将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三（β -氯乙基） 酯，30~40°C水浴反应0. 5h~3h。 rTRAIL突变体的制备过程参见授权公告号为CN 102936281 B的中国专利技术专利。 rTRAIL突变体（单体）上存在较多的游离巯基，因此单体之间会通过二硫键形成多聚体，但 该多聚体结构是不稳定的，磷酸三（β-氯乙基）酯（TCEP)可以使不稳定的多聚体解聚，保 持单体状态，反应体系中的锌离子进一步促使rTRAIL突变体单体形成稳定的三聚体，在稳 定的rTRAIL突变体三聚体中，突变获得的109位半胱氨酸巯基将游离出来。 (2)将rTRAIL突变体三聚体与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺混合反应，得到聚乙 二醇-rTRAIL突变体三聚体偶联物； 作为优选，rTRAIL突变体三聚体与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为 I: L 5~8,反应温度20~30°C，反应时间30s~lh。 (3)将聚乙二醇-rTRAIL突变体三聚体偶联物与带连接臂的海兔毒素混合反应， 得到所述聚乙二醇-rTRA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚乙二醇‑rTRAIL突变体三聚体‑海兔毒素偶联物，rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于，所述rTRAIL突变体三聚体上偶联有单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺以及带连接臂的海兔毒素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘利强，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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