一种在模拟环境中测试肽段的离子传输情况的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种在模拟环境中测试肽段的离子传输情况的方法，所述测试方法为荧光光谱法，所述离子为金属离子，该测试方法包括六个步骤：制备缓冲溶液、制备金霉素的标样储备液、制备未添加肽段的磷脂单层囊泡、荧光检测未添加肽段的磷脂单层囊泡、制备添加肽段的磷脂单层囊泡、荧光检测添加肽段的磷脂单层囊泡。本发明专利技术针对第四跨膜蛋白区的肽段，进一步改进测试方法及测试条件，本发明专利技术的测试方法解决了现有技术中操作复杂、专业性高、成本高、对仪器和操作人员要求均较高的缺点，更便于深入研究第四跨膜蛋白区功能肽段的离子传输情况，并得以揭示整体溶质转运蛋白传输体的传输功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种在模拟环境中测试肽段的离子传输情况 的方法。
技术介绍
基因组排序数据揭示出在DNA破译的蛋白质中的四分之一膜蛋白，膜蛋白是一类 具有特殊结构的蛋白质，它镶嵌于磷脂膜中，处于细胞与外界的交界部分。膜蛋白基本分为 外周蛋白和内在蛋白两大类。贯穿整个磷脂双层膜的膜蛋白又称为跨膜蛋白。膜蛋白控制 着许多生命体的基本活动过程，如细胞的生长、分裂和调亡、细胞间各种信号的传输、生命 体的嗅觉味觉等。膜蛋白形成各种神经信号分子、激素和底物的受体，构成传输离子的离子 通道和物质的转运体。膜蛋白在疾病控制中以及新药研发中起重要作用，在新药研发中，约 有70%的药物靶点为膜蛋白。溶质转运蛋白SlclIal (也叫Nrampl)就是这些重要膜蛋白 中的一员，由548个残基构成，它与人类的一些传染病和自免疫疾病密切相关。溶质转运蛋 白具有典型的膜整合蛋白特征的多肽分子，有10-12个假定的疏水跨膜区、1-2个N-糖基化 的胞质外环状结构和一个胞质内进化上高度保留的具有转运蛋白特征的结构。 一个糖基化的胞外环状结构和几个胞内未知loop区的磷酸化部位具有传输Fe2+， Zn2+，和Mn2+等金属离子的功能，是一种重要的金属离子传输体。其中第四跨膜蛋白区（TM4) 参与形成了质子偶合的金属离子选择性传输路径，G169D突变导致传输金属离子的功能完 全丧失或部分丧失，Slcllal基因调节哺乳动物对病原体感染的抵抗能力，第四跨膜区的 G169D突变将导致巨噬细胞抵抗多种病原体感染能力的降低或丧失。由此可见，研宄第四跨 膜蛋白区功能肽段的离子传输情况可以揭示整体溶质转运蛋白传输体的传输功能，该研宄 有助于我们认识完整蛋白的功能。Slcllal作为Slcll家族的一员在哺乳动物抵抗病菌感 染和人类对一些传染病的防御方面发挥着重要的作用，对它结构和取向的揭示不仅可以帮 助我们了解Slcllal传输体的传输机理，而且在疾病的治疗和新药的开发方面也有着潜在 的意义。 为了更好的观测第四跨膜蛋白区功能肽段的离子传输情况，现有技术中出现了大 量针对观测第四跨膜蛋白区功能肽段的离子输出情况的方法。例如电压钳位观测法、单通 道电流记录观测法等。 电压钳位观测法，一般而言，膜对某种离子通透性的变化是膜电位和时间的函数。 通过玻璃微电极与细胞膜之间形成紧密封接，利用电子学技术施加一跨膜电压并把膜电位 固定于某一数值，可以测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程。利用药物或 改变细胞内外的溶液成分，使其他离子通道失效，即可测定被研宄的某种离子通道的功能 性参量，分析离子电流的稳态和动力学与膜电位、离子浓度等之间的关系，可推断该种通道 的电导、活化和失活速率、离子选择性等，并能测量和分析通道的门控电流的特性。但该方 法观测第四跨膜蛋白区的离子传输情况较复杂，试验结果还需进一步计算和比较才能得出 第四跨膜蛋白区功能肽段的离子传输情况的结果。 单通道电流记录观测法，又称膜片钳位技术，用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表 面，使之形成10~IOOGQ的密封，被孤立的小膜片面积为μ m2量级，内中仅有少数离子通 道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的ρΑ(10-12安培）量级的 电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得 到各种尚子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与 膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧 向外或膜的内侧向外等方式进行实验研宄。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶 液成分以及施加药物都很方便。应用电压钳位或单通道电流记录技术，可分别于不同时间、 不同部位（膜内侧或外侧）施用各种浓度的药物，研宄它们对通道各种功能的影响。结合 对药物分子结构的了解，不但可以深入了解药物和毒素对人和动物生理功能作用的机制， 还可以从分子水平得到通道功能亚单位的类型和构象等信息，上述技术均是在活体细胞中 进行，具有操作复杂、专业性高、成本高、对仪器和操作人员要求均较高的缺点。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术采用荧光光谱法在模拟环境中测试肽段的离子传 输情况的方法，解决了现有技术中操作复杂、专业性高、成本高、对仪器和操作人员要求均 车父尚的缺点。 荧光光谱法常用在蛋白质与小分子相互作用的研宄中。通过对一些荧光参数的测 定（荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振、荧光淬灭）可得到许多关于蛋白质与小分子 作用的信息如结合常数、结合位点数、结合位置、作用力类型、蛋白质分子在相互作用中结 构的变化以及蛋白质所处的极性环境等多种信息。荧光光谱广泛应用于膜蛋白的研宄。利 用荧光淬灭的方法可以确定跨膜蛋白在膜中埋入的深度以及外界环境条件的变化对蛋白 质位置的影响。本专利技术将在模拟环境中采用荧光光谱法测试跨膜蛋白功能肽段的离子传输 情况，针对第四跨膜蛋白区，进一步改进测试方法及测试条件，使得本专利技术的测试方法解决 了现有技术中操作复杂、专业性高、成本高、对仪器和操作人员要求均较高的缺点，更便于 深入研宄第四跨膜蛋白区功能肽段的离子传输情况，并得以揭示整体溶质转运蛋白传输体 的传输功能。 本专利技术的技术方案为： -种在模拟环境中测试肽段的离子传输情况的方法，所述测试方法为焚光光谱 法，所述离子为金属离子，所述方法包括以下步骤： 步骤一：制备缓冲溶液：用去离子水配制PH值范围在3~7的磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲溶液200~300ml，并加入氯化钠； 步骤二：制备金霉素的标样储备液：将金霉素用超纯水稀释，使其浓度为0. 05g/ L~0. 2g/L，用超声溶解，密封备用； 步骤三：制备未添加肽段的磷脂单层囊泡：将质量为0. 5~2. Omg二肉豆蔻酰磷 脂酰甘油放入样品管，加入氯仿和甲醇体积比为2 : 1混合溶剂80~150 μL，待二肉豆蔻 酰磷脂酰甘油完全溶解后吹入氮气直至溶剂挥发完全，脂质体在管的底部形成一层透明的 薄膜，真空干燥15~25h后，向样品管中加入金霉素的标样储备液和缓冲溶液，在水浴中超 声，得到单层囊泡，使得金霉素分散在单层囊泡的内部和外部； 步骤四：荧光检测：选择激发波长为280~380nm，测量步骤三制备的未添加跨膜 蛋白的磷脂单层囊泡荧光光谱图，记录其最大发射波长λ_ 1;将二价金属离子加入到步骤 三的溶液中制备成待测液Α，测量待测液A荧光光谱图，记录其最大发射波长λ max2;放置时 间大于24h后，测量待测液A的荧光光谱图，记录其最大发射波长λ max3; 步骤五：制备添加肽段的磷脂单层囊泡：制备肽储备液，将质量为0. 5~2. Omg二 肉豆蔻酰磷脂酰甘油放入样品管，加入氯仿和甲醇体积比为2 : 1混合溶剂80~150 μ 1， 加入体积为15~30 μ 1的肽储备液，摇匀待二肉豆蔻酰磷脂酰甘油完全溶解后吹入氮气直 至溶剂挥发完全，脂质体在管的底部形成一层透明的薄膜，真空干燥15~25h后，向样品管 中加入金霉素的标样储备液和缓冲溶液，在水浴中超声，得到单层囊泡，使得金霉素分散在 单层囊泡的内部和外部； 步骤六：荧光检测：选择激发波长为280~380nm，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在模拟环境中测试肽段的离子传输情况的方法，其特征在于，所述测试方法为荧光光谱法，所述离子为金属离子，所述方法包括以下步骤：步骤一：制备缓冲溶液：用去离子水配制pH值范围在3～7的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液200～300ml，并加入氯化钠；步骤二：制备金霉素的标样储备液：将金霉素用超纯水稀释，使其浓度为0.05g/L～0.2g/L，用超声溶解，密封备用；步骤三：制备未添加肽段的磷脂单层囊泡：将质量为0.5～2.0mg二肉豆蔻酰磷脂酰甘油放入样品管，加入氯仿和甲醇体积比为2∶1混合溶剂80～150μl，待二肉豆蔻酰磷脂酰甘油完全溶解后吹入氮气直至溶剂挥发完全，脂质体在管的底部形成一层透明的薄膜，真空干燥15～25h后，向样品管中加入金霉素的标样储备液和缓冲溶液，在水浴中超声，得到单层囊泡，使得金霉素分散在单层囊泡的内部和外部；步骤四：荧光检测：选择激发波长为280～380nm，测量步骤三制备的未添加跨膜蛋白的磷脂单层囊泡荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax1；将二价金属离子加入到步骤三的溶液中制备成待测液A，测量待测液A荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax2；放置时间大于24h后，测量待测液A的荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax3；步骤五：制备添加肽段的磷脂单层囊泡：制备肽储备液，将质量为0.5～2.0mg二肉豆蔻酰磷脂酰甘油放入样品管，加入氯仿和甲醇体积比为2∶1混合溶剂80～150μl，加入体积为15～30μl的肽储备液，摇匀待二肉豆蔻酰磷脂酰甘油完全溶解后吹入氮气直至溶剂挥发完全，脂质体在管的底部形成一层透明的薄膜，真空干燥15～25h后，向样品管中加入金霉素的标样储备液和缓冲溶液，在水浴中超声，得到单层囊泡，使得金霉素分散在单层囊泡的内部和外部；步骤六：荧光检测：选择激发波长为280～380nm，测量步骤五制备的添加肽段的磷脂单层囊泡荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax4；将二价金属离子加入到步骤五的溶液中制备成待测液B，测量待测液B荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax5；待其稳定后测量待测液B的荧光光谱图，记录其最大发射波长λmax6，比较λmax1～λmax6的数值结果。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐海燕，翟明翚，王颖，苏立强，张晓红，刘晓兰，祖广权，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23