土壤中植物病原菌含量的检测方法技术

本发明专利技术公开了土壤中植物病原菌含量的检测方法。本发明专利技术所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法包括：包括S1)和S2)：S1)用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；S2)以待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定待测土壤中植物病原菌的含量；提取土壤微生物DNA的方法包括S21)和S22)：S21)向土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；S22)向细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中土壤中植物病原菌含量的检测方法。
技术介绍
土传病害对植物危害严重。其病原微生物存在于土壤中，环境稳定、病原抗逆能力强，难以进行化学防治。如：十字花科根肿病(Clubroot)是由专性寄生的芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woronin.)引起的世界性土传病害。该病为害十字花科白菜、油菜、甘蓝、薹菜等多种栽培品种，致使根部肿大，生长不良，萎蔫、矮化，产量和质量受损，严重威胁十字花科作物的生产。植物土传病害发生的主要决定因子是播种前土壤中病原菌的含量，对土壤中植物病原菌的定量检测是采取合理防治措施的基础。土壤中植物病原菌的检测有多种方法，如：种植感病植株、荧光显微镜检测、血清学检测、常规PCR检测和荧光定量PCR检测等。我国不同地区的土壤类别、有机质含量和pH值差异很大。同时，土壤中富含酚类、酯类、腐植酸、重金属离子等，影响DNA的提取和后续的PCR反应。目前，土壤样品DNA的制备多采用试剂盒方法，土壤样品的处理量为0.25g-1g，其生物学代表意义差，不适合大量土壤样品检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测土壤中植物病原菌的含量。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了土壤中植物病原菌含量的检测方法。本专利技术所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；所述磷酸缓冲液为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM(即所述磷酸缓冲液中H2PO4-和HPO42-的浓度之和为100mM)，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述裂解细胞的时间可为2小时，所述裂解细胞的温度可为65℃。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述探针可标记有报告基团和荧光淬灭基团。所述报告基团具体可为FAM或ROX；所述荧光淬灭基团具体可为TAMARA或Eclipse。在本专利技术的一个实施例中，所述探针的5’端标记有FAM，所述探针的3’端标记有TAMARA。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，S21)可包括下述S21a)和S21b)：S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述细胞悬液中土壤颗粒的直径在50微米以下。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒可用德国Retsch生产的PlanetaryBall Mill PM 400仪器处理所述土壤悬液。所述处理的时间可为5-20分钟，具体可为10分钟。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的杂质得到DNA溶液；S22b)用PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)除去所述DNA溶液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液由水、NaCl和PEG组成；所述PEG溶液中所述PEG的质量百分浓度为20％-50％，所述NaCl的浓度为1.6M。所述PEG具体可为PEG8000。所述20％-50％具体可为30％。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述S22a)包括A1)和A2)：A1)将所述裂解液进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b1；A2)将所述提取液b1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b2，除去所述提取液b2中的杂质，得到所述DNA溶液；上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液的体积可为所述上清液a2体积的1/2。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述上清液a2和所述PEG溶液的反应温度可为4℃；所述上清液a2和所述PEG溶液的反应时间可为1小时。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b2中的杂质可包括如下步骤：将所述提取液b2进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c1，向所述沉淀c1中加入体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b3，除去所述提取液b3中的杂质，得到所述DNA溶液。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b3中的杂质可包括如下步骤：将所述提取液b3进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c2，向所述沉淀c2中加入TE buffer，得到所述DNA溶液；所述TE buffer由水和溶质组成，所述TE buffer的pH为8.0，所述溶质及其浓度为10mM Tris-HCl、1mM EDTA。上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述向所述沉淀c2中加入TE buffer的温度可为50-60℃。所述50-60℃具体可为55℃。...

【技术保护点】
土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris‑HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP；所述磷酸缓冲液由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。...

【技术特征摘要】
1.土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：
S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生
物DNA；
S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光
定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所
述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述
PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA
组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：
S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；
S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质
量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测
土壤微生物DNA；
所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度
为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百
分比浓度)PVP；所述磷酸缓冲液由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶
质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S21)包括下述S21a)和S21b)：
S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；
S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述提取土壤微生物DNA的方
法中，所述除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：
S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的杂质得到DNA溶液；
S22b)用PVPP除去所述DNA溶液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；
所述PEG溶液由水、NaCl和PEG组成；所述PEG溶液中所述NaCl的浓度为1.6M，
所述PEG的质量百分浓度为30％-50％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述S22a)包括A1)和A2)：
A1)将所述裂解液进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称
为上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称
为提取液b1；
A2)将所述提取液b1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液

\t称为上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，将
该提取液称为提取液b2，除去所述提取液b2中的杂质，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张力群，郭松，张俊威，陈伟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11