本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A（Iturin A）及其同系物的高效制备方法。本发明专利技术将能够产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属菌株及其遗传改良菌，在第一级液体培养基中培养,然后作为种子液接种到第二级液体培养基中；第二级液体培养基接种种子液后进行发酵培养及流加氨基酸等的补料培养。发酵结束后，从发酵培养液中收集伊枯草菌素A及其同系物。本发明专利技术具有生产效率高、易于工业化等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高效制备伊枯草菌素A（Iturin A）及其同系物的方法。
技术介绍
伊枯草菌素A(Iturin A）及其同系物，主要来源于芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物和动物病原菌的抗菌物质。尤其Iturin A具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。通常芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）产生两类次生代谢产物，一类是具有生物表面活性剂功能的生物表面活性素（Surfactin）,另一类是抗真菌活性的伊枯草菌素A（Iturin A）及其同系物。伊枯草菌素类物质是多种同系物组成的混合物，其中主要成分为Iturin A，基本结构(见附图1)是一个由7个α-氨基酸组成的环肽，在N-末端为β-氨基脂肪酸。其侧链上的脂链基团的大小差别，构成了其同系物。Iturin A的结构与活性密切相关，其侧链上的脂链基团越大（n值越大），活性越强；它的抗真菌活性还与目标细胞的细胞膜有关，它通过在细胞膜上形成离子通道，提高细胞膜的通透性从而作用于靶位点。医学上也用天然的Iturin A在一些人和动物的皮肤真菌感染方面做临床实验。由于它的广谱抗真菌性以及低毒和低变态反应性，使其很有希望成为一种高价值的抗真菌药物。然而，迄今为止，国内外均没有高效的伊枯草菌素A及其同系物的生产方法。尤其是利用芽孢杆菌属（Bacillus）菌株例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）发酵生产伊枯草菌素A及其同系物的技术没有突破，其产量低、成本高，发酵 工艺控制难度较大，制约着其工业化生产和商业化应用。从近几十年来国内外的报道看,伊枯草菌素A及其同系物的发酵工艺研究历程主要分三个阶段,第一阶段（1995年以前）是传统的液体深层发酵（submerged fermentation,SMF）,主要集中在探索发酵条件对生物量和产量的影响。Sandrin等人（1990）用枯草芽孢杆菌S499进行摇瓶培养生产伊枯草菌素A和surfactin，其最高产量分别为280mg/liter（培养72h时）和760mg/liter。Shoda等人(1991,1993)用枯草芽孢杆菌NB22进行小型罐液体发酵，通过改变发酵过程中温度和通气量来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到620mg/liter（培养72h时）。Hbid等人(1996)用枯草杆菌S499进行20L发酵罐发酵，通过改变发酵过程中氧传递的控制来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到1388mg/liter。在这一阶段的研究工作中主要面临的困难是泡沫溢出的问题，而化学消泡剂的使用又受到限制，因为化学消泡剂影响氧的传递速率并影响微生物的生理特性。第二阶段（1992-2007）是固体发酵（solid stated fermentation,SSF）,日本东京技术学院资源利用研究室是该阶段的重要贡献者。Akihiro等人（1993，1995）用小麦麸皮作为底物进行伊枯草菌素的生产，其产量较深层发酵提高了5-6倍，之后他们尝试用豆腐下脚料作为发酵底物，其产量较深层发酵提高了6-8倍。Mizumoto等人（2006，2007）固体发酵生产iturin，其产量分别达到3300mg/kg湿固体培养基和5591μg/g湿固体培养基。固体发酵较深层发酵的优势是发酵过程简单，菌体和产物浓度更大，而且提取时要用的溶剂更少。但因为固态发酵生产设备受到诸多因素的限制，易污染杂菌等问题，使该技术应用于大规模发酵生产受到严重制约。为了能够提高液态发酵的产量，研究工作者更多的是从发酵的新方法上去寻找出路，所以伊枯草菌素发酵工艺第三阶段（2004-）的研究主要是集中在发酵方法的创新上，该阶段研究的最大贡献者还是日本东京技术学院资源利用研究室的研究人员。2006年，该研究室Mohammad等人通过热激活诱导分批发酵晚期的孢子重新萌发进行二次发酵生产伊枯草菌素，其产量较一次发酵提高了1.0g/L，达到了4.0g/L。二次发酵是发酵方法上的巨大的革新，具有很大的应用潜力。也就在一年之后，2007年，还是Mohammad等人用重组菌株B.sutbtilis168在生物膜上静置培养生产伊枯草菌素A，其产量较传统的深层发酵提高了2倍，达到0.8g/L。但在生物膜上，菌体的快速增长导致营养供应不足，结果导致产 生较多的孢子，影响发酵效果。2004年日本昭和电工株式会社，Yoneda,Tadashi(米田正等)在申请的专利中（WO2004/029273；2005年CN1685056A）介绍了Iturin A及其同系物的制备方法。具体为使用菌株B.subtilis SD142及其突变株1、2，在含有2%或者更多浓度大豆粉的合成培养基中生产1.5g/L或更多产量的Iturin A及其同系物的方法。其进行了5L罐发酵研究，结果，在野生株SD142的发酵液中，Iturin A及其同系物的产量达到3.8g/L；用突变菌株1、2的发酵液中，Iturin A及其同系物的产量达到了6.7g/L；但该方法生产成本依然偏高，并且存在随着氮源的增加，发酵产生泡沫严重，增加发酵工艺难度等弊病，难以实现工业化生产。2009年，专利ZL200910058559.9报道，采用枯草芽孢杆菌的遗传改良菌株Bacillus subtilis ZK-H6（CGMCC No.2897）或Bacillus subtilis ZK-3（CGMCC No.0924），加入吸附固定化细胞材料和黏稠剂，接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液的补料发酵培养，Iturin A及其同系物产量可达到8.0g/L。本专利技术人长期从事枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的次生代谢产物研究工作。在对一株植物内生枯草芽孢杆菌（B subtilis）进行遗传改良后发现，突变株Bacillus subtilis ZK-H28具有高产Iturin A及其同系物，几乎不产或微量产生Surfactin的特性。随后，本专利技术人对利用枯草芽孢杆菌（B subtilis）发酵制备Iturin A及其同系物的工艺参数和技术方法进行了研究，获得了提高发酵体系中菌株细胞密度、有效控制发酵产生的泡沫、补充Iturin A及其同系物合成的氨基酸前体等高产Iturin A及其同系物的技术方法，因此完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的：本专利技术的目的之一，是提供一种“氨基酸及液体培养基流加补料发酵工艺技术”，发酵生产Iturin A及其同系物；本专利技术的目的之二，是提供一种用于生产Iturin A及其同系物的新菌株；本专利技术的目的之三，是提供用于生产Iturin A及其同系物的培养基。本专利技术的目的之四，是提供用于生产Iturin A及其同系物的流加氨基酸前体的方法。更具体地说，本专利技术提供一种制备Iturin A及其同系物的方法，包含以下步骤：将能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伊枯草菌素A及其同系物的高效制备方法，包括菌种、制备工艺，其特征是：所用菌种为能够产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属菌株，如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株及上述菌株的遗传改良菌，制备工艺分为两级，第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A,第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在适合的条件下培养一段时间后，进行氨基酸补料液和补料液Ｃ的流加补料发酵培养；发酵结束后，从上述发酵培养液中收集伊枯草菌素A及其同系物。
【技术特征摘要】
1.一种伊枯草菌素A及其同系物的高效制备方法，包括菌种、制备工艺，
其特征是：所用菌种为能够产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属菌株，
如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌
(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、
坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株及上述菌株的遗传改良菌，制备工艺分
为两级，第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A,第二级为发酵培
养，所用培养基为液体培养基B；在适合的条件下培养一段时间后，进行氨基
酸补料液和补料液Ｃ的流加补料发酵培养；发酵结束后，从上述发酵培养液
中收集伊枯草菌素A及其同系物。
2.权利要求1所述的伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：
所述菌种为枯草芽孢杆菌的遗传改良菌株Bacillus subtilis ZK-H28，CGMCC
No.7321。
3.根据权利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：
按g/mL计，培养基及补料液的具体组成如下：
培养基A：
可溶性淀粉 0.2%-6.0% 甘油 0.3%-2.0% 葡萄糖 0.1%-10.0%
蛋白胨 0.1%-3.0% 酵母膏 0.1%-2.0% 硫酸镁 0.01%-1.0%
磷酸二氢钾 0.2%-1.0% 氯化钠 0.01%-1.0%
培养基B：
玉米粉 0.3%-4.0%，麦芽糖 0.3%-2.0%，蔗糖/糖蜜 0.5%-3.0%，
甘油 0.5%-1.5%，葡萄糖 1.5%-5.0%，蛋白胨 0.7%-4.0%，
黄豆粉或黄豆粉水解液1.5%-8.0%，酵母膏0.5%-2.0%，鱼骨粉...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭红，钟娟，周金燕，彭文璟，杨杰，肖亮，张智，舒丹，罗笛，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51
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