一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法，属于抗菌药物技术领域。该方法主要包括利用具有负电性的多阴离子诱导阳离子短肽组装形成水溶性阳离子多聚体进而增强阳离子短肽与细菌细胞膜间的键合能力，同时有效避免传统阳离子短肽在细菌细胞膜表面的缓慢迁移、聚集等不足，最终极大提高了阳离子短肽的抗菌性及稳定性。这种方法的优势在于通过简单、方便的步骤提高了阳离子短肽抗菌性和稳定性的目的。此外，这种方法突破了传统抗菌肽序列过长、合成复杂、价格昂贵、难以批量合成、稳定性差等限制，极大扩展了抗菌肽的种类范围，有望在多肽抗菌药物的开发、筛选及应用方面发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法
本专利技术属于抗菌药物
，具体涉及一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的有效方法。
技术介绍
细菌感染所引起的疾病危害严重威胁着人类健康和生命安全。虽然人们合成了众多抗菌药物(又称抗生素)来抑制细菌的活性，但抗生素在临床上的大量应用使细菌的抗药性明显增加(Stark,M.；Liu,L.-P.andDeber,C.M.Antimicrob.AgentsChemother.,2002,46,3585-3590.)，有的甚至产生了多重抗药性，引发重大公共安全事故。如上世纪50年代欧美地区发生的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStphylococcusaureus，简称MRSA)感染很快蔓延至全球，导致约5000万人被感染，50多万人死亡。随后，探索、开发具有持久功效的新型抗菌药物成为全球科研工作者的重要任务。人们经过大量研究发现天然阳离子肽可通过静电作用吸附到细菌细胞膜表面，进而在细胞膜表面迁移、组装、聚集，最终导致细菌细胞的瓦解、凋亡(Herzog,I.M.andFridman,M.,Med.Chem.Commun.,2014,5,1014-1026)。这种通过破坏细胞膜而引起细菌死亡的方式不易使细菌对其产生抗药性，因此，阳离子肽有望作为广谱抗菌剂用以解决人类社会共同面临的细菌抗药性问题。迄今为止，通过人工合成或天然提取的抗菌阳离子肽已经超过2500种(参见抗菌肽数据库http://aps.unmc.edu/AP/main.php)，其中有99％以上的抗菌肽是包含多个氨基酸残基(氨基酸数12-50)的两亲性长链肽，而两亲性短链抗菌肽(氨基酸数小于10)的数量只占不到0.5％。尽管长链抗菌肽具有高效的抗菌生物活性，但其作为临床药物使用还存在产率低、成本高、价格昂贵、难以大批量生产、稳定性差及体内循环寿命短等缺点。与长链肽相比，阳离子短肽的制备简单，产率较高，成本低，有利于批量合成，是理想的临床药物(Won,A.；Pripotnev,S.；Ruscito,A.andIanoul,A.J.Phys.Chem.B,2011,115,2371-2379)。然而，大多数合成的阳离子短肽其抗菌性严重不足，难以满足实际要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单、有效的方法用以提高阳离子短肽的生物抗菌性和稳定性，为抗菌肽的低成本开发，筛选及应用提供重要参考。提高阳离子短肽的抗菌性及稳定性将是开发低成本抗菌药物的有效途径。本专利技术通过引入客体分子来调控阳离子短肽的构象及聚集状态，利用两者的协同组装解决阳离子短肽抗菌性低和稳定性差等问题。考虑到阳离子短肽的正电性特征及自排斥效应，选用具有负电性的多阴离子客体来屏蔽自排斥作用，同时利用具有负电性的多阴离子客体的尺寸效应及特定的刚性结构诱导阳离子短肽的二级结构发生变化。具有负电性的多阴离子客体可与阳离子短肽通过多重离子键合作用相连接，相邻肽链之间进一步通过氢键、疏水及π-π作用形成有序的组装体。得到的有序组装体有效增加了阳离子短肽与细菌细胞膜的键合强度从而表现出很好的抗菌性。同时，协同组装过程也将阳离子短肽极易降解的活性位点包埋在组装体中降低了阳离子短肽与混合人血清中酶的接触，提高了稳定性。具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽通过离子自组装形成宽为10～16纳米，长为0.3～3微米的纤维状阳离子多聚体。阳离子多聚体对革兰阴性菌和革兰阳性菌具有很好的抑制效果。此外，与单独的阳离子短肽相比，多聚体在混合人血清中的降解速率大大降低，稳定性明显提高。本专利技术包括以下步骤：(1)阳离子短肽的制备：本专利技术涉及的阳离子短肽(氨基酸残基数低于8)其基本结构由亲水的碱性L-氨基酸(如赖氨酸)和含疏水基团(如甲基，苯环，吲哚环，偶氮苯等)的L-氨基酸构成。阳离子短肽的合成可通过标准的微波辅助固相法实现：以酰胺树脂为基材，以9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸为原料，干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(纯度大于99.5％)为反应溶剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐为偶联试剂，N,N-二异丙基乙胺为活化剂进行氨基酸缩合偶联反应，哌啶为去保护试剂除去9-芴甲氧羰基基团。通过反复的9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸缩合偶联以及去除9-芴甲氧羰基保护基等步骤在酰胺树脂表面依次偶联相应的9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸。本专利技术中选用的9-芴甲氧羰基-L-氨基酸包括：9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-色氨酸，9-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-L-丙氨酸等商品化的氨基酸，以及化学合成的9-芴甲氧羰基-4’-偶氮苯基-L-苯丙氨酸(合成详见文献Chem.Commun.,2012,48,8796-8798)。待偶联反应完成后，利用三氟乙酸将酰胺树脂与阳离子肽链剥离，获得设定的阳离子短肽，其结构式如下所示：其中，阳离子短肽序列按照从N端到C端的顺序分别描述如下：KazoKazoKazoK；KazoKWKazoK；KazoKFKazoK；KazoKAKazoK；KWKazoKWK；KazoKazoK(K代表赖氨酸，W代表色氨酸，F代表苯丙氨酸，A代表丙氨酸，azo代表4’-偶氮苯基-L-苯丙氨酸)。(2)阳离子多聚体的制备：本专利技术中选用的具有负电性的多阴离子客体为Na3AlMo6O18(OH)6、H4SiW12O40、K6P2W18O62、1,3,6,8-芘四磺酸钠盐或四苯基卟啉四磺酸。具体步骤如下：①阳离子短肽和具有负电性的多阴离子客体分别溶于二次蒸馏水中得澄清、透明溶液，控制阳离子短肽的赖氨酸数与具有负电性的多阴离子客体的电荷数之间的比例为4:1～2:1，在室温搅拌的条件下将具有负电性的多阴离子客体水溶液逐滴加入到阳离子短肽水溶液中，最终得到阳离子短肽浓度为0.05～0.5mg/mL的水溶液；②将上述溶液继续搅拌1h～3h，并在4～40℃温度范围内静置12～48h，在这一过程中具有负电性的多阴离子客体通过静电相互作用诱导阳离子短肽从无规构象转变为β折叠构象，随后组装成表面为赖氨酸基团的阳离子多聚体；从而实现阳离子短肽的抗菌性和稳定性的提高。所得到的阳离子多聚体是由具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽交替排列形成的宽为10～16纳米、长为0.3～3微米的纤维状结构。(3)阳离子多聚体的抗菌性和稳定性：将细菌细胞培养液(革兰阴性菌如大肠杆菌、酵母菌，革兰阳性菌如黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)加入无菌的试管中，向试管中加入阳离子多聚体溶液，最终阳离子短肽的浓度为0.05～0.077mg/mL；将上述配好的样品置于转数为80～240转/分且温度为37℃的恒温摇床中培养。取不同培养时间(0～525分钟)的上述溶液，用核酸蛋白测定仪测定相应的光密度值(OD600)，以评价阳离子多聚体的抗菌性。商品化的混合人血清稀释10倍，将稀释后的混合人血清水溶液与阳离子多聚体混合，使得最终阳离子短肽的浓度为0.05～0.1mg/mL，混合人血清体积分数为0.08～0.16％。所得溶液置于转数为80～240转/分且温度为37℃的恒温摇床中培养。取不同培养时间(0～24小时)的上述溶液，分别用高效液相色谱仪及质谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法，其步骤如下：(1)将阳离子短肽和具有负电性的多阴离子客体分别溶于二次蒸馏水中得澄清、透明的溶液，控制阳离子短肽的赖氨酸数与具有负电性多阴离子客体的电荷数之间的比例为4：1～2：1，在室温搅拌的条件下将具有负电性的多阴离子客体水溶液逐滴加入到阳离子短肽水溶液中，最终得到阳离子短肽浓度为0.05～0.5mg/mL的水溶液。(2)将上述溶液继续搅拌1h～3h，并在4～40℃温度范围内静置12～48h，得到表面为赖氨酸基团、由具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽交替排列形成的纤维状结构的阳离子多聚体，从而实现阳离子短肽的抗菌性和稳定性的提高。

【技术特征摘要】
1.一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法，其步骤如下：(1)将阳离子短肽和具有负电性的多阴离子客体分别溶于二次蒸馏水中得澄清、透明的溶液，控制阳离子短肽的赖氨酸数与具有负电性多阴离子客体的电荷数之间的比例为4：1～2：1，在室温搅拌的条件下将具有负电性的多阴离子客体水溶液逐滴加入到阳离子短肽水溶液中，最终得到阳离子短肽浓度为0.05～0.5mg/mL的水溶液；(2)将上述溶液继续搅...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敬芳，李文，吴立新，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22