一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法技术

本发明专利技术提供一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法，其主要技术要点在于在大肠杆菌中共表达热激蛋白基因和海藻糖合成酶基因，且还包括，在表达海藻糖合成酶的体系中外源添加海藻糖。通过该方法合成得到的海藻糖合成酶具有更高的热稳定性，从而使得该酶具有更好的环境适应性，更高的催化效率。

Method for improving thermal stability of trehalose synthetase

The present invention provides a method for improving the thermal stability of trehalose synthase, the main technology is characterized in Escherichia coli the expression of heat shock protein gene and trehalose synthase gene, and also includes the addition of trehalose in the expression of exogenous trehalose synthase system. The trehalose synthetase synthesized by this method has higher thermal stability, which enables the enzyme to have better environmental adaptability and higher catalytic efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法
本专利技术属于生物
或者酶工程
，涉及一种海藻糖合成酶的表达过程，具体涉及在微生物中表达该海藻糖合成酶，并提高其热稳定性的方法。
技术介绍
海藻糖合成酶（EC5.4.99.16）是一种新型变位酶，通过分子内转塘基作用将α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖一步转化为α,α-1,1糖苷键连接的海藻糖，工艺简单，易于调控，适合工业放大生产。海藻糖合成酶一步酶催化过程既不消耗高能物质（如UDP，二磷酸尿核苷），也不依赖磷酸，且底物麦芽糖目前生产技术成熟，廉价易得，与成品海藻糖相比有较大的价格空间。现已发现的海藻糖合成酶分子量集中在60-80kDa，报道的麦芽糖转化率在50%-70%左右，其中转化率较高的海藻糖合成酶基因多来自极端微生物和嗜热菌，也体现了海藻糖的抗逆性。海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性二糖，作为一种天然的非特异性生物保护剂备受人们的瞩目。随着海藻糖应用范围日益扩大，市场需求不断增加。海藻糖化学性质非常稳定，1,1糖苷键决定海藻糖本身为非还原性，耐水解性，与蛋白质相互作用显示出化学惰性，具有较高的热稳定性和较宽的pH稳定范围，不与蛋白质或氨基酸发生美拉德反应。自然界中，海藻糖可以作为碳源/能源，调节渗透，是细菌细胞壁的结构成分，干燥保护剂，防冻剂，免疫原性（分枝杆菌的索状因子）和植物生长调节剂。海藻糖对多种生物活性物质具有保护作用，可以在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣条件下在细胞表面形成保护膜，有效保护蛋白质分子不变性失活，在科学界素有“生命之糖”的美誉。蛋白质的质量控制系统，即蛋白质内稳态，包括蛋白质合成、折叠、去折叠和周转。细胞内，分子伴侣不仅可以识别并帮助新合成蛋白的折叠，且对许多错误折叠蛋白的聚集-降解具有调控作用。细胞内大多数天然蛋白质能自发形成比较稳定的天然结构（或配体、代谢因子辅助稳定），但10%-20%新合成的多肽链需要分子伴侣的帮助才能正确折叠。分子伴侣网络和蛋白酶系统是保证蛋白质正常功能的两大质量控制系统。分子伴侣广泛存在于生物体内，保护蛋白质胞内合成与运输，防止其产生聚集；或应激各种外界压力，辅助其合成正确的蛋白质。Drummond及其同事用同位素标记酵母细胞中的蛋白质，高温处理细胞（细胞不致死），紧接着迅速冷冻，获取细胞内源蛋白的实时变性图像并通过质谱分析蛋白质的聚集。研究院推测高温导致蛋白变性的同时，刺激细胞过量表达分子伴侣热激蛋白，协助变性蛋白的复性，蛋白质变性聚集的复合体可能会重塑蛋白合成途径，抑制大多数正在翻译的新蛋白，避免新合成蛋白的变性聚集。蛋白质整体结构上的刚性和催化中心柔性之间的平衡，共同决定了酶的热稳定性。（EdwardW.J.WALLACE,etal.Reversible,specific,activeaggregatesofendogenousproteinsassembleuponheatstress[J].Cell,2015,162(6):1286-1298.）。本课题组已经在前期研究中构建了一株能产海藻糖合成酶的大肠杆菌工程菌，已于2012.05.22申请了中国专利技术专利并已授予专利权，专利公开号为CN102690795A，专利技术名称为“一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用”。目前，通过蛋白质工程对海藻糖合成酶的合成过程进行改造，进一步提高酶的催化效率，具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提高海藻糖合成酶催化麦芽糖生成海藻糖反应中酶的催化效率，以降低催化剂成本。为了解决本专利技术的技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法，其中，在大肠杆菌中共表达热激蛋白基因和海藻糖合成酶基因，且还包括，在表达海藻糖合成酶的体系中外源添加海藻糖。本专利技术所述的方法，其中，所述热激蛋白基因为GroEL/S基因（GENEBANKID94866/ID948655），DnaK/J基因（GENEBANKID944750/ID944753），TF基因（GENEBANKID945081），GrpE基因（GENEBANKID947097）中的一种或多种。本专利技术所述的方法，其中，所述海藻糖的添加浓度为0.25-1mol/L。本专利技术所述的方法，其中，所述热激蛋白和海藻糖合成酶通过诱导表达，且在表达过程中，依次诱导表达热激蛋白，海藻糖合成酶；且在海藻糖合成酶诱导表达后外源添加海藻糖。本专利技术所述的方法，其中，所述热激蛋白由阿拉伯糖诱导表达，由葡萄糖抑制热激蛋白的表达，阿拉伯糖的诱导浓度为0.5-4mg/mL，葡萄糖的抑制浓度为0.5-2mg/mL；海藻糖合成酶由IPTG诱导表达。本专利技术所述的方法，其中，诱导表达所述热激蛋白时，大肠杆菌OD600值为在0.2-0.4之间；诱导表达所述海藻糖合成酶时，OD600值为在0.6-0.8，诱导表达的时间为8-12h。本专利技术所述的方法，其中，所述海藻糖合成酶基因为Tres基因。在一个优选的方案中，将灰产色链霉菌海藻糖合成酶pET28a-Tres质粒，与热激蛋白质粒pG-KJE8(DnaK-DnaJ-GrpEGroES-GroEL)，pGro7(GroES-GroEL)，pKJE7(DnaK-DnaJ-GrpE)，pG-TF2(GroES-GroEL-tig)，pTF16(tig)采用热激法共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达。其中，海藻糖合成酶pET28a-Tres质粒抗性为kan，工作浓度为30-50ug/mL，使用浓度为0.1-1mmol/L的IPTG在OD600达到0.6-0.8时诱导；热激蛋白质粒抗性为cmr，工作浓度为20ug/mL，使用浓度为0.5-4mg/mLL-阿拉伯糖和或1-10ng/mL四环素在OD600达到0.2-0.4时诱导热激蛋白的表达，使用浓度为0.5-2mg/mL葡萄糖抑制热激蛋白的表达。具体的，将具有共表达能力的菌株以1.5%的接种量转接到新的液体LB培养基中。当大肠杆菌工程菌37℃培养1h左右，OD600达到0.2-0.4，含有pG-KJE8(DnaK-DnaJ-GrpEGroES-GroEL)使用L-阿拉伯糖和四环素作为诱导剂，pGro7(GroES-GroEL)，pKJE7(DnaK-DnaJ-GrpE)，pTF16(tig)使用L-阿拉伯糖作为诱导剂，pG-TF2(GroES-GroEL-tig)使用四环素作为诱导剂。葡萄糖抑制阿拉伯糖操纵子的表达，作为对照。37℃培养2h左右，OD600达到0.6-0.8，加入IPTG诱导海藻糖合成酶的表达。同时，在大肠杆菌的培养过程中的任一时间段加入海藻糖，优选在海藻糖合成酶诱导表达以后加入海藻糖后，使海藻糖在体系中的浓度为0.25-1mol/L。在本专利技术的有益效果在于：（1）通过在培养过程中的措施，有效提高了在高温条件处理后海藻糖合成酶的催化效率，有利于其催化麦芽糖合成海藻糖的过程。（2）经过改造，海藻糖合成酶耐热温度得到提高，可以抵御环境的恶劣程度，进而降低对生产环境的要求。（2）本专利技术的技术原理可能在于：海藻糖作为一种化学分子伴侣，通过维持细胞的渗透压，稳定蛋白质的天然结构，提高蛋白质抵抗外界各种压力的能力，作用方式类似于分子伴侣，是独立于分子伴侣系统的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法，其特征在于，在大肠杆菌中共表达热激蛋白基因和海藻糖合成酶基因，且还包括，在表达海藻糖合成酶的体系中外源添加海藻糖。

【技术特征摘要】
2016.04.11 CN 20161021966121.一种提高海藻糖合成酶热稳定的方法，其特征在于，在大肠杆菌中共表达热激蛋白基因和海藻糖合成酶基因，且还包括，在表达海藻糖合成酶的体系中外源添加海藻糖。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热激蛋白基因为GroEL/S基因，DnaK/J基因，TF基因，GrpE基因中的一种或多种。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻糖的添加浓度为0.25-1mol/L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热激蛋白和海藻糖合成酶通过诱导表达，且在表达过...

【专利技术属性】
技术研发人员：江凌，杨鑫，黄和，唐苏苏，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32