一种多肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于医学领域，公开了一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，该多肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记，可用于制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽及其应用
本专利技术属于医学领域，涉及一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用。
技术介绍
前列腺癌(PCa)已成为目前危害全球男性健康的主要恶性肿瘤，早期主要通过外科手术和放射治疗，但早期发现困难，就诊时多数已发生远处转移。未经治疗的PCa细胞多为雄激素依赖性，即通过阻断雄激素促使雄激素依赖性癌细胞凋亡，但雄激素依赖性PCa经过一段时间(平均14-30月)内分泌治疗后，大多数转为非激素依赖性前列腺癌(androgenindependentprostatecancer,AIPC)，最终转化为激素难治性前列腺癌(Hormonerefractoryprostatecancer,HRPC)，目前对于HRPC及其转移灶尚无有效的治疗方法，临床统称为难治性前列腺癌，是导致PCa预后差、死亡率高的主要原因。125I、103Pd粒子近距离放射治疗及外放疗是HRPC的治疗手段，但主要限于局部病灶。针对多发病灶的靶向内放射性治疗近年来备受关注，177Lu是理想靶向内放射治疗性核素，常用于抗体、多肽及其类似物等的标记，且177Lu通过反应堆辐射产生，具有低成本和易得性，具有适宜的物理半衰期(6.7d)，发射的β-粒子传能线密度及生物学效应高于125I，组织平均射程小于200μm，适合杀死癌细胞，发射的γ射线可用于SPECT显像，以监测和指导治疗过程，因此，如何增加理想治疗性核素177Lu在HRPC及转移灶的靶向性聚集和滞留是改善其预后亟待解决的难题，其中受体和配体的选择尤为重要。前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen，PSMA)是一种II型跨膜糖蛋白，其大小约为100-120kD。它由3部分构成：短的胞内段(氨基酸1-18)，跨膜段(氨基酸19-43)和较长的胞外段(氨基酸44-750)，在高度恶性原发性PCa、HRPC及其转移灶的肿瘤细胞表面呈高丰度表达，且随PCa恶性进展而升高，而在前列腺、肾脏、肺脏、肝脏等正常组织、炎性增生性组织及其它良性病变细胞表面表达水平极低、甚至不表达，成为HRPC及其转移灶靶向治疗的主要靶蛋白。作为配体，多肽较抗体分子量小，稳定性好，无免疫源性，不被网状内皮系统非特异性摄取，可通过化学修饰连接NOTA、CB-TE2A、PCTA、DOTA等偶联物，进行放射性核素(如68Ga，111In，90Y，177Lu等核素)标记，体外类合成(如固相法)过程简单、经济，为广泛临床应用提供了基础。更重要的是，多肽作为放射性核素载体，通过结构优化可获得体内药代动力学良好如血清除快、靶向特异性好、结合稳定的多肽。若能够研制出一种能与PSMA胞外区特异性结合特性和具有靶向功能的多肽，对于PCa的诊断和治疗具有较好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题提供一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽。上述与PSMA膜外区靶向性结合的多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1；SEQIDNO:1：Glu-Val-Pro-Arg-Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Val-Phe-Leu。进一步的，所述多肽与PSMA胞外段，氨基酸44-750，靶向结合，并与偶联剂通过聚乙二醇(PEGn，n＝0,1,2,3)连接，所述偶联剂介导多肽的放射性核素的标记。进一步的，所述偶联剂为DOTA、或NOTA、或CB-TE2A、或Hynic。进一步的，所述放射性核素为68Ga，或111In，或90Y，或177Lu，或64Cu。上述与PSMA膜外区靶向性结合的多肽还具有在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。本专利技术还提供一种制备上述与PSMA膜外区靶向性结合的多肽的方法，包括以下步骤：①多肽从C端到N端方向合成，先在树脂上挂第一个氨基酸，称取2.0g树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺DMF，活化30min左右，然后称取第一个氨基酸Fmoc-Leu(But)-OH0.5mmol，4-二甲氨基吡啶DMAP75mg，N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC1ml加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h；反应完毕用DMF洗4～6次，加入适量吡啶和甲醇，体积比为1:1，反应30min；反应完毕用DMF洗4～6次；然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；②称取第二个氨基酸Fmoc--Phe-OH1.5mmol，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU1.5mmol于反应管中，加入DIEA0.5ml，反应40min，用DMF洗4～6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；③以下氨基酸反应方法同②；④称取0.75mmol偶联剂DOTA，HBTU1.5mmol于反应管中，加入N,N-二异丙基乙胺DIEA0.25ml，经过用茚三酮检测试剂检测，检测为无色；⑤最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固体，经HPLC纯化，冻干，得多肽DOTA-PSMAP。本专利技术还提供一种将权利要求1中所述的多肽制备成放射性核素标记多肽的方法，配置权利要求1所述的DOTA-PSMAP多肽溶液为2mg/ml；HEPES为1M，PH为7；放射性核素溶液为1-10mCi/ml；取25μl的HEPES液，分别依次加入0.7-5μlDOTA-PSMAP多肽溶液和100μl的放射性核素溶液，置于95℃的水浴锅中加热，反应15-30min即得到放射性核素-DOTA-PSMAP。步骤④中的偶联剂DOTA，还可以替换成其他的，例如或NOTA、或CB-TE2A、或Hynic。放射性核素溶液为68GaCl3，或64CuCl2，或111InCl3，或177LuCl3。本本专利技术首次通过体外固相法合成PSMA膜外区靶向性结合的小分子直线多肽，其结构为多肽氨基酸序列为Glu-Val-Pro-Arg-Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Val-Phe-Leu(SEQIDNo:1)，即谷氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸(以下简称PSMAP)，可与PSMA胞外段(氨基酸44-750)靶向结合，并与偶联剂(如DOTA、NOTA、CB-TE2A、Hynic等)通过聚乙二醇(PEGn，n＝0,1,2,3)连接，偶联剂介导多肽的放射性核素(如68Ga、64Cu、111In、177Lu和99mTc)的标记。其中放射性核素可以是显像性放射性核素如64Cu、68Ga、111In，也可以是治疗性放射性核素如90Y、177Lu等。体外实验考查其体外稳定性，体内实验考察其体内药代动力学和生物学分布，并通过MicroPET/CT(或microSPECT/CT)显像评价其在前列腺癌肿瘤部位的放射性摄取。本专利技术的有益效果：本专利技术制备的小分子多肽PSMAP，能与PSMA膜外区靶向性结合，利用该多肽制备的放射性核素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
2014.11.26 CN 20141069394751.一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1；所述多肽与PSMA胞外段氨基酸44-750靶向结合，并与偶联剂通过聚乙二醇PEGn，n=0,1,2,3连接，所述偶联剂介导多肽的放射性核素的标记；所述偶联剂为DOTA、NOTA、CB-TE2A或Hynic；所述放射性核素为68Ga、111In、90Y、177Lu或64Cu。2.一种制备权利要求1所述与PSMA膜外区靶向性结合的多肽的方法，包括以下步骤：①多肽从C端到Ｎ端方向合成，先在树脂上挂第一个氨基酸，称取2.0g树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺DMF，活化30min左右，然后称取第一个氨基酸Fmoc-Leu（But）-OH0.5mmol，4-二甲氨基吡啶DMAP75mg，N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC1ml加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h；反应完毕用DMF洗4~6次，加入适量吡啶和甲醇，体积比为1:1，反应30min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵国强，王自正，王峰，王书奎，杨劲松，徐友娣，赵红东，
申请(专利权)人：南京市第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32