一种离体组织培养紫萁的方法技术

离体组织培养紫萁的方法，剪取紫萁孢子囊穗顶端未成熟的绿色孢子囊穗；外植体消毒，紫萁孢子囊穗切成段，接种于琼脂培养基中培养；将萌发的幼原叶体转接于原叶体增殖琼脂培养基中，温度23-26℃，光照12h/d强度2300-2500 lx；已增殖原叶体取出放入装有液体培养基的无菌三角瓶中，孢子培养中培养基1/2MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.01mg/L，摇床上振荡4-10min，分别取适量的原叶体接入放有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，倒入MS液体培养基，培养；萌发孢子体转接于放有滤纸桥或棉花的培养瓶中，倒入孢子体增殖液体培养基；培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蕨类植物的组织培养，尤其涉及一种离体组织培养紫萁的方法。
技术介绍
紫萁是一种分布广泛的蕨类植物，其嫩叶可食，称“薇菜”，为著名的山珍。其根茎可入药，有清热解毒、抑菌等功效，具有一定的应用价值。近年来，因为人为过度采摘，自然资源逐渐枯竭。在自然环境中，蕨类植物主要通过孢子进行繁衍，或通过根、根状茎、叶等部位产生无性孢和顶端分生组织产生新植株。然而，自然条件下孢子成苗率很低，不能满足市场和社会发展的需要，不利于种群的扩大和人工栽培。本专利技术是对紫萁孢子离体培养各阶段的培养基配方和培养条件，为其工厂化育苗提供技术手段。紫萁（薇菜）作为蕨类植物，在其生活史中，要经历孢子体和配子体两个世代，其配子体有性生活世代的授精过程中需要水作为介质，用常规的离体培养方法很难获得成功，本专利技术根据蕨类植物的这一特点，探索出一套紫萁（薇菜）离体培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种离体组织培养紫萁的方法，具体步骤如下：1：外植体的选择紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗。2：消毒将外植体放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的外植体放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次。3：接种在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子切成小段，每段约0.5cm长，接种于孢子萌发琼脂培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx。4：原叶体的增殖培养将萌发的幼原叶体转接于原叶体增殖琼脂培养基中培养：培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx。5：诱导原叶体受精萌发孢子体，将已增殖的原叶体取出放入装有液体培养基的无菌三角瓶中，在摇床上振荡4-10min（振荡的目的是为了促进原叶体的授精），然后分别取适量的原叶体接入放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的MS液体培养基，放入培养室培养。培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx。6：孢子体增殖培养将萌发的孢子体转接于放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的孢子体增殖液体培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx。本方法有很多优势，曾经有人研究采用仿生态栽培的方法，即无性繁殖的方法和有性繁殖的方法，无性繁殖中将采取的紫萁贯众的根状茎在湿沙中保存，到4月或10月将每段保持1-2个芽的若干段，保持一定量的须根，栽培入土。同时受自然条件的影响较大，不利于紫萁大规模的培养。有性繁殖中培养基是砂石与土壤、草炭土等要严格控制其比例和大棚的温度、湿度、光照和培养基的酸碱度和肥力。这些方法都需要大量的采掘野生蕨类资源作为母种，对于水土保持和野生资源的保护都是不利的，本专利技术的方法可以大规模培养紫萁试管苗，不需花大量的人力、劳力。对野生资源的采掘非常有限，用几株孢子体就可以繁殖几千上万株试管苗，且不受蚯蚓、蝼蛄等地下害虫的危害，占用场地小，保护野生资源，避免过度采掘，本专利技术有利于对紫萁的大规模工厂化生产提供条件。具体实施方式本专利技术由以下的实施例加以说明：材料与方法材料选取紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗。取紫萁孢子囊穗的成熟度为：成熟度Ⅰ是紫萁孢子叶顶端未成熟孢子囊穗，成熟度Ⅱ是稍微展开的紫萁孢子叶中段的黄褐色中等成熟孢子囊穗，成熟度Ⅲ是紫萁孢子叶的最下端的完全展开的深褐色紫萁已成熟孢子囊穗。诱导孢子体萌发形成原叶体的培养配制诱导孢子体萌发形成原叶体养基配方为：MS稀释一定浓度添加不同浓度激素的组合琼脂培养基配方，经高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件为高压0.1Kpa，温度为121℃，时间为20min，然后取出待其冷却凝固后备用。培养方法将未成熟的紫萁的孢子囊穗剪取放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的紫萁孢子囊穗放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次。在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子囊穗切成小段，每段约0.5cm长，接种于诱导孢子体萌发形成原叶体的培养基中培养；培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500lx。孢子成活率=(萌发的孢子数/接种的总孢子数)×100%。原叶体(配子体)增殖培养选取萌发的原叶体，接种到原叶体(配子体)增殖培养基配方的培养基中培养。培养基高压蒸汽灭菌备用（灭菌条件为高压0.1Kpa，温度为121℃，时间为20min）。培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500lx。培养时间为一个月。诱导原叶体受精萌发孢子体培养条件:振荡后在液体MS培养基上培养一个半月至三个半月。在超净工作台上将继代培养出的原叶体取出接入三角锥瓶中，放在摇床上振荡，振荡时间有5min--10min。然后接种在放有棉花或者滤纸桥的培养瓶中，再加入诱导原叶体受精萌发孢子体液体培养基20mL。培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500lx。孢子体增殖培养紫萁原叶体大约培养20天左右，表面开始出现绿色原叶体团或原叶体簇。在显微镜下可见孢子体在其中萌发，此时将萌发的孢子体转接于放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的孢子体增殖液体培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体组织培养紫萁的方法，其特征在于：培养紫萁的方法步骤如下：1）外植体的选择：取紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗；2）消毒：将外植体放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的外植体放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次；3）接种：在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子切成小段，每段约0.5cm长，接种于孢子萌发琼脂培养基中培养；培养条件：温度23‑26℃，光照时间12h/d，光照强度2300‑2500 lx；4）原叶体的增殖培养：将萌发的幼原叶体转接于原叶体增殖琼脂培养基中培养：培养条件，温度23‑26℃，光照时间12h/d，光照强度2300‑2500 lx；5）诱导原叶体受精萌发孢子体：将已增殖的原叶体取出放入装有液体培养基的无菌三角瓶中，在摇床上振荡4‑10min促进原叶体的授精，分别取适量的原叶体接入放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的MS液体培养基，放入培养室培养；培养条件：温度23‑26℃，光照时间12h/d，光照强度2300‑2500 lx；6）孢子体增殖培养将萌发的孢子体转接于放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的孢子体增殖液体培养基中培养；培养条件：温度23‑26℃，光照时间12h/d，光照强度2300‑2500 lx。...

【技术特征摘要】
1.一种离体组织培养紫萁的方法，其特征在于：培养紫萁的方法步骤如下：1）外植体的选择：取紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗；2）消毒：将外植体放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的外植体放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次；3）接种：在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子切成小段，每段约0.5cm长，接种于孢子萌发琼脂培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500lx；4）原叶体的增殖培养：将萌发的幼原叶体转接于原叶体增殖琼脂培养基中培养：...

【专利技术属性】
技术研发人员：周迅，
申请(专利权)人：遵义师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52