基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物和方法技术

本发明专利技术公开了基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物和方法，其引物序列如SEQ ID NO.7～17所示，该引物是根据B淋巴细胞受体重链(IGH基因)体细胞重排、非模版随机插入缺失、体细胞超突变和类型转换重组的规律设计，并在正向引物和反向引物的上游添加测序接头，该引物能高效扩增模板，能够用于构建免疫组库；本发明专利技术还公开了构建人BCR重链文库的方法，该方法简单，能够快速构建人BCR重链文库，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物和方法
本专利技术属于生物
，具体涉及基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物和利用该引物构建人BCR重链文库的方法。
技术介绍
得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的
已经被应用于T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)进而启动免疫系统活化。通过测序淋巴细胞受体的CDR3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程及其发生机制。B细胞受体(BCR)由两条重链和两条轻链，共四条肽链组成，重链由IGH基因编码，轻链分别由IGL(Lamda链)和IGK(Kappa链)编码，同时由于重链具有更复杂的内部组成因而能更好的反映BCR的组成状况。IGH基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为IGHV，IGHD，IGHJ，IGHC四组片段，在B淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的IGH分子，为BCR的多样性提供了分子遗传基础。在IGHD-IGHJ，IGHV-IGHD的连接处，由于非模版核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了BCR分子的多样性程度。B细胞活化过程中，由于体细胞超突变(即亲和力成熟)及重组类型转换的作用，BCR的多样性进一步增加。而IGH基因的互补决定区3(CDR3)刚好覆盖IGHV-Junction-IGHD-Junction-IGHJ区域，包括了IGH基因几乎全部的多样性信息，因此，对于B淋巴细胞IGH基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物；本专利技术的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建人BCR重链文库的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQIDNO.7～17所示。2、利用权利要求1所述多重PCR引物构建人BCR重链文库的方法，先提取正常胃黏膜组织、胃癌组织或外周血总RNA，然后以SEQIDNO.1～6所示序列为反转录引物反转合成cDNA，再以合成的cDNA为模板、SEQIDNO.7～17所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得人BCR重链文库。优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了构建人BCR重链文库的多重PCR引物，该引物能够扩增IGH基因CDR3区多样性序列，构建成BCR重链文库，建立了构建人IGH基因CDR3区测序文库的操作流程，实现了B细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为凝胶成像检测目的条带图(1：DL2000；2、3：人BCR重链文库条带)。图2为BCR重链文库统计结果。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、提取人组织中总RNA人组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：a.取人正常胃黏膜组织、胃癌组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存；b.按每微升Trizol加入200μl氯仿，颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃、12000g离心15min；c.取水相，按每微升Trizol加入200μl氯仿颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃条件下12000g离心15min；d.再取上层水相，按每微升Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，然后于4℃条件下12000g离心10min，弃上清；e.沉淀按每微升Trizol加入1ml体积分数为75％的乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，然后于4℃、8000g离心5min，吸去上清，沉淀于室温(18～25℃)晾干；d.晾干后用无RNA酶水溶解，得RNA。将提取所得RNA用epoch测定RNA浓度和质量。检测结果显示，OD260/OD280在1.8～2.0左右。再利用变性胶电泳检测28s，18s和5s。检测结果显示，条带明显，28s/18s在2.0左右。上述检测结果表明本实施例提取的RNA质量满足建库需求，能够用于后续建库。实施例2、逆转录和多重PCR将实施例1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用RevertAidFirstStrandcDNASysthesiskit，具体操作按试剂盒说明书进行，其反应体系为：总RNA0.1～5μg，浓度为20pmol的反转录引物1μL，加入DEPC处理水定容至12μL，然后将混合液在PCR仪中65℃孵育5min，然后迅速放入冰中冰浴5min，然后加入5×reactionbuffer4μL，RibolockTMRNase抑制剂(20μ/μL)1μL，1mMdNTPMix2μL，revertAidTMM-MuLV反转录酶200μ/μL1μL，混匀后，离心，然后在42℃条件下孵育1h，得第一链cDNA。其中反转录引物的具体序列为：hsIGGRTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnnaagaccgatgggcccttg-3’(SEQIDNO.1)；hsIGARTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnngaagaccttggggctggt-3’(SEQIDNO.2)；hsIGMRTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnngggaattctcacaggagacg-3’(SEQIDNO.3)；hsIGDRTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnngggtgtctgcaccctgata-3’(SEQIDNO.4)；hsIGE.1RTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnngaagacggatgggctctgt-3’(SEQIDNO.5)；hsIGE.2RTUIDvlmr：5’-tgactggagttcagacgtgtgnnnnnnnnttgcagcagcgggtcaaggg-3’(SEQIDNO.6)，n＝a/c/g/t。根据B淋巴细胞受体重链(IGH基因)体细胞重排、非模版随机插入缺失、体细胞超突变和类型转换重组的规律，设计多重PCR引物，为方便测序在正向引物和反向引物的上游添加的测序接头，具体引物如表1所示：表本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引物如SEQ ID NO.7～17所示。

【技术特征摘要】
1.基于高通量测序构建人BCR重链文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引物如SEQIDNO.7～17所示。2.利用权利要求1所述多重PCR引物构建人BCR重链文库的方法，其特征在于：先提取正常胃黏膜组织、胃癌组织或外周血总RNA，然后以SEQIDNO.1～6所示序列为反转录引物反转合成cDNA，再以合成的cDNA为模...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾罄竹，万瑛，陈钢，于海礼，关鹏，张建阳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85