黄花蒿黄烷酮3‑羟化酶基因AaF3HY及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种黄花蒿黄烷酮3‑羟化酶基因AaF3HY，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。黄花蒿黄烷酮3‑羟化酶AaF3HY能够催化黄烷酮形成3‑羟基黄烷酮，为体外催化黄烷酮生成3‑羟基黄烷酮，以及黄花蒿体内调控儿黄花蒿组分的组成提供了一种新的可选择途径。此外，本发明专利技术通过原核表达制备重组AaF3HY，克服了直接从黄花蒿中分离该蛋白的困难，降低了成本。

【技术实现步骤摘要】
黄花蒿黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY及其编码蛋白与应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种黄花蒿黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY及其编码蛋白与应用。
技术介绍
黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)又名臭蒿，为菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)植物，黄花蒿叶、花和茎中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。根据三碳键(C3)结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；黄烷酮(又称二氢黄酮)和黄烷酮醇(又称二氢黄酮醇)；异黄酮；异黄烷酮(又称二氢异黄酮)；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮(又称澳咔)；黄烷和黄烷醇；黄烷二醇(3，4)(又称白花色苷元)。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如原珍向天果、槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物，研究发现芦丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定等均有明显的扩冠作用；槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、葛根总黄酮、银杏叶总黄酮对缺血性脑损伤有保护作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；银杏叶总黄酮、葛根素、大豆苷元等对心肌缺氧性损伤有明显保护作用。此外，沙棘总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮(主要为甘草素和异甘草素)具有抗心律失常作用。木犀草素、黄岑苷、黄岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；从菊花、獐牙菜中分离得到的黄酮单体对HIV病毒有较强抑制作用，大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A对HIV病毒也有一定抑制作用。黄花蒿中含有丰富的黄酮类化合物，研究表明黄花蒿叶黄花蒿具有抑制多种肿瘤细胞的药理功能，其机理可能与黄花蒿叶中黄酮类化合物的抗氧化作用、抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关。由此可见黄花蒿叶黄酮类化合物具有重要的开发前景。然而，目前对黄花蒿黄酮类化合物的生物合成及其调控机理不清楚，尚无相关的关键酶基因克隆的报道。本专利技术以花青素含量差异非常显著的两个黄花蒿为材料，采用cDNAAFLP技术，从中获得差异表达基因，在此基础之上通过半定量RT-PCR、生物信息学、过表达、体外酶反应以及基因沉默的方法对候选基因进行功能验证，最终获得了一条黄花蒿黄烷酮3-羟化酶基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄花蒿黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术的另一目的在于提供上述黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术的黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY是从黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中克隆得到的一种新的黄烷酮3-羟化酶基因(现将该基因命名为AaF3HY)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，该基因全长为2136bp，分析表明，该序列包含一个完整的编码区1095bp，5’非翻译区(UTR)563bp，3'非翻译区441bp和polyA尾巴37bp，编码364个氨基酸组成的蛋白(黄烷酮3-羟化酶)。由该基因编码的黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。该蛋白的分子量为41.18KDa，等电点为5.67。为便于表述，将该黄烷酮3-羟化酶命名为AaF3HY。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本专利技术黄烷酮3-羟化酶基因还包括由SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码AaF3HY的核苷酸序列。此外，应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列(SEQIDNo.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第56位的L替换为I。因此，本专利技术黄烷酮3-羟化酶还包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与AaF3HY同等活性的由AaF3HY衍生得到的蛋白质。本专利技术的又一目的是提供含有黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY的重组表达载体pET28a(+)-AaF3HY和基因沉默载体pHellsgate8-AaF3HY。将本专利技术的AaF3HY基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本专利技术蛋白的重组表达载体或抑制本专利技术基因表达的基因沉默载体，进一步将该重组表达载体或者基因沉默载体导入适当的宿主细胞中，获得表达本专利技术AaF3HY的基因工程菌，或者转基因黄花蒿或组织。在本专利技术实施例中，根据AaF3HY编码区序列设计包含酶切位点的引物，通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上，测序正确后将AaF3HY克隆到原核表达载体pET28的多克隆位点，转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行诱导表达，优化条件，获得具有活性的黄烷酮3-羟化酶。实验表明，AaF3HY能够催化黄烷酮形成3-羟基黄烷酮。在本专利技术实施例中，根据AaF3HY全长序列设计引物，扩增AaF3HY全长序列中的300bp-600bp的基因片段，通过BP反应连接到pDONR221构建中间载体，测序正确后将中间载体与pHellsgate8通过LR反应获得AaF3HY基因沉默载体pHellsgate8-AaF3HY，转化农杆菌农杆菌LBA4404，浸染黄花蒿叶片等外植体，获得转基因黄花蒿或组织，其体内AaF3HY表达水平得以改变，从而调控黄烷酮与3-羟基黄烷酮的比例。本专利技术首次提供了一种黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY序列，其编码蛋白其能够催化黄烷酮形成3-羟基黄烷酮，为体外催化黄烷酮生成3-羟基黄烷酮，以及黄花蒿体内调控儿黄花蒿组分的组成(黄烷酮与3-羟基黄烷酮的比例)提供了一种新的可选择途径。此外，本专利技术通过原核表达制备重组AaF3HY，克服了直接从黄花蒿中分离该蛋白的困难，降低了成本。附图说明图1是cDNA-ATLP分离花青素含量高和低的黄花蒿叶中差异表达基因电泳图。其中：A-花青素含量高的黄花蒿叶；B-花青素含量低的黄花蒿叶；M-Marker。图2是半定量RT-PCR分析花青素含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄花蒿黄烷酮3‑羟化酶基因AaF3HY，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种黄花蒿黄烷酮3-羟化酶基因AaF3HY，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.含有权利要求1所述基因的表达载体。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，该载体为重组表达载体pET28a(+)-AaF3HY和基因沉默载体pHellsgate8-AaF3HY。4.含有权利要求1所述基因的宿主菌。5.权利要求1所述的黄花...

【专利技术属性】
技术研发人员：田娜，曹娟，易庆峰，熊硕，杨威，田冬铭，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43